生物三维扫描电子显微镜

生物电子显微镜学家面临的一个重大挑战一直是如何从二维图像中解释复杂结构。扫描电子显微镜(SEM)通常用于成像细胞、组织和整个多细胞生物的表面。表面的扫描电镜图像似乎是三维的(3D)，但在图像中没有可测量的深度信息。成像和计算技术的改进导致了几种扫描电镜技术的发展，使生物样品的高分辨率3D分析成为可能。

黄蜂的背散射电子图像。虽然图像显示为3D，但它不包含深度信息，无法测量。

立体成像和摄影测量技术是使用从不同角度捕获的相同区域的样本图像，将它们重新组合成表面的3D模型。表面轮廓和深度测量是可能的模型数据。这些技术的范围有限，但对不能被损坏的样品很有用，如博物馆标本，或对表面形貌分析很重要的地方。

蜜蜂的红青色立体图像。使用立体眼镜可以从图像中获得深度信息。图像可以进行数字处理，为详细的测量和分析提供3D模型。

详细的超微结构信息，传统上只能使用透射电子显微镜(TEM)，现在可以使用高分辨率场发射sem对冷冻和树脂嵌入的样品进行收集，样品可以是平面的(用玻璃或金刚石刀修整)或切割成截面。背向散射的电子在样品中提供原子对比度，从而产生倒立的tem类图像。在扫描电镜中收集三维超微结构数据主要有三种技术;串行切片阵列层析成像，串行块面扫描电镜(SBFSEM)和聚焦离子束扫描电镜(FIBSEM)。

阵列层析成像，串行块面扫描电镜和聚焦离子束扫描电镜示意图。

叶片组织的背散射电子扫描电镜图像显示内质网和叶绿体(左)和相同的图像倒置，图像看起来类似于使用TEM获得的数据类型(右)。

FIBSEM

FIBSEM利用离子束烧蚀样品，在一侧形成一个表面平坦的沟槽，可用于电子束成像。一旦表面的图像被收集，离子束被用来磨掉一个薄层(3-5nm)从成像区域。捕获第二个图像，重复这个过程，建立一个图像堆栈。FIBSEM还可以将样品磨成薄片，用作TEM切片，这在低温应用中特别有用。万博电脑网页版登录在所有的3D扫描电镜技术中，FIBSEM提供了Z区最好的分辨率，可以用于冷冻水合样品和树脂嵌入室温样品。然而，它也具有这些方法中最小的视场和最低的体积容量，并有额外的缺点，破坏被成像的样本区域。

SBFSEM

SBFSEM使用一个金刚石刀安装在扫描电镜样品室的显微扫描仪上，切片样品的表面。样品的切割面被成像，然后用刀修剪掉另一部分。从非常稳定的样品中可以去除薄至15nm的薄片，但更常见的薄片范围为20至100nm。这意味着X和y分辨率通常比z分辨率好。在某些样品和显微镜上，使用电子束的可变电压可以恢复一些额外的z分辨率。与FIBSEM一样，SBFSEM是一种破坏性的方法，以后不可能重新检查剖面。SBFSEM也仅限于有大量对比的室温样品。SBFSEM可以成像相对较大的组织体积(数百微米)和较大的表面积，避免了特定的切片工件，如压缩和起皱。树脂块容易损伤光束和充电，需要采取措施，如使用气体注入系统或在显微镜中可变压力或非常低的加速电压，这将降低对比度。SBFSEM是所有技术中在指定体积上进行设置和数据收集的最快方法。

数组x线断层摄影术

阵列层析成像技术包括在超显微组上生成连续切片，并将其安装到存根或晶圆上，然后再将其插入显微镜。每个切片按顺序成像，同一区域可以在不同的放大率和分辨率下重复成像多次。染色和免疫标签可以在包埋后应用到样品上，一旦感兴趣的区域被定位，就可以在成像后应用到样品上，这是目前SBFSEM无法做到的。阵列断层扫描对可成像组织的体积没有限制，是最灵活的系统。然而，z分辨率受切片厚度的限制(最多30nm)，容易产生皱纹、压缩和其他切片特定的工件。