图像分析有助于基于蛋白质纳米颗粒的水产养殖疫苗策略的开发

随着病毒性疾病对水产养殖的威胁日益增加，迫切需要高效和廉价的新型疫苗，同时最大限度地减少环境风险并符合法规。在Imaris图像分析软件的帮助下，来自Autònoma de Barcelona大学的Rosemary Thwaite和Nerea Roher及其同事正在开发一种使用鱼类病毒抗原制成的蛋白质纳米颗粒为养殖鱼类制造疫苗的方法。

Thwaite说:“这种生物材料提供了一种替代可溶性重组蛋白的方法，而可溶性重组蛋白无法忍受鱼类胃肠道的恶劣环境。”“纳米颗粒是一种生物活性的、强大的替代品，不需要任何封装，可以以廉价和可扩展的方式生产。”

观察纳米颗粒摄取

对于新方法，研究人员开发了针对水产养殖业相关鱼类病毒的蛋白质纳米颗粒，包括传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和病毒性坏死病毒(VNNV)。

除了研究纳米颗粒的结构外，研究人员还测试了纳米颗粒在斑马鱼细胞系中的吸收情况。为此，他们用ato -488 NHS酯(绿色)标记纳米颗粒并进行细胞检测。

研究人员还用共聚焦显微镜对纳米颗粒摄取成像，以确保颗粒在细胞内，因为细胞计数术无法区分附着在表面的颗粒和内化的颗粒。使用Imaris软件，他们分析了共聚焦图像，以获得颗粒如何在细胞质中分布的3D视图，并可视化颗粒穿透细胞膜。

Thwaite说:“Imaris还可以让我们量化每个细胞的粒子数量和被分析细胞中允许细胞的百分比。”“能够定位和计数粒子是该软件的一个有用功能，所提供的图像使我们能够立即看到细胞内发生的情况。”

研究人员使用Imaris Cell检测细胞、细胞核和囊泡。他们通过种子点对细胞核进行分类，并利用细胞膜对细胞进行分割。在人工估计纳米颗粒的大小后，研究人员将颗粒检测为斑点，允许不同的大小，然后将斑点导入囊泡，最后将囊泡导入细胞。

量化每个细胞的粒子数

如图所示，Imaris分析显示靶向IPNV的纳米颗粒被67%的细胞所吸收，每个允许细胞约有50个纳米颗粒。靶向VHSV的纳米颗粒被100%的细胞吸收，平均每个细胞88个颗粒。这些结果与细胞检测结果一致。

斑马鱼肝细胞系(ZFL)摄取病毒抗原纳米颗粒(NPs)。将荧光标记的NPs (A) IPNV-VP2NP和(B) VHSV-G-frg16NP添加到ZFL中。对照组(ctl)为不含NPs的ZFL。(a)细胞术:剂量-反应。2份NPs 1-20µg/mL孵育细胞12 h。采用Dunnett多元比较检验的单因素方差分析(one-way ANOVA)分析了处理与对照之间的差异。显著性水平*p < 0.05;* * p < 0.01;***p < 0.001;* * * * p < 0.0001。 (b) Confocal microscopy and (c) digitalized image (z-stacks) of ZFL cells after 14 h incubation with NPs at 20 µg/mL (A) and 10 µg/mL (B). NPs are green (Atto-488), cell membrane red (Cell mask Deep Red) and nuclei blue (Dapi). Control confocal images ZFL without NPs. Image courtesy of Rosemary Thwaite, Universitat Autònoma de Barcelona.

“总的来说，在这篇论文中，我们证明了纳米颗粒被利用了在体外由斑马鱼肝细胞和在活的有机体内通过给斑马鱼插管来证明口服给药的概念，”Thwaite说。“我们还表明，纳米颗粒能引发抗病毒的先天免疫反应在体外在基因表达研究中。”

接下来，研究人员计划在养殖鱼类中测试纳米颗粒，看看这些颗粒是否会引发针对目标病毒的保护性免疫反应。

作者感谢来自Servei de Microscòpia, Universitat Autònoma de Barcelona的N. Barba。

研究论文:王志刚，王志刚，王志刚，王志刚，王志刚，王志刚，2018。由重组病毒抗原制成的蛋白质纳米颗粒:一种有前途的口服鱼类避孕药生物材料。前沿免疫。2018年7月18日;9:1652。doi: 10.3389 / fimmu.2018.01652。eCollection 2018。