突触的高通量定量分析

为了更好地了解神经回路的功能，卡内基·梅隆大学的艾莉森·巴特（Alison L.

巴特说：“我们想了解在学习或疾病期间神经元的投入的组织如何变化。”“对突触如何在大量神经元中分布的定量分析的能力可以为神经元如何在重要过程中重新组织其网络提供重要的见解。”

可再现分析

在神经元网络中发生的变化涉及以高度可重现的方式研究其联系。巴特解释说：“这需要非常具体的标准来识别联系人。”“这可以使用Imaris软件来完成，因为它允许将特定参数设置为一致检测不同动物不同细胞的突触。”

研究人员还需要在三个维度上追踪和渲染神经元，然后为其分配特定的突触点。巴特说：“这不是一个微不足道的过程，尤其是在三个维度工作时。”“它需要强大的软件，例如Imaris，不仅可以检测特定功能，而且还可以自动化该检测。”

该研究的主要研究人员迪卡·库尔吉斯（Dika Kuljis）通过检查神经元跨神经元的抑制性突触的分布来使用其新试剂和IMARIS分析工作流程。大脑中有多种分子定义的抑制性GABA能神经元。但是，研究人员不想仅仅识别抑制性突触，他们还想看看突触前的突触的何处。

使用iMaris荧光点检测方法。a，导入Imaris的图像文件。比例尺= 40微米。B，原始突触荧光信号。C，突触荧光信号的增益调整后的视图可视化昏暗的YFP信号。D，突触荧光的白色面罩可将信号与背景区分开。E，PuncTA创建参数：0.5微米估计的直径，大于三个体素大小（灰色像素）。F，所有荧光点的3D渲染（黄色）。g，从细胞表面（边缘到边缘;蓝色）的0.5微米内的点击量。H，分离的细胞相关点（蓝色）。 I, J, Cytoplamic puncta (≤0.5 micron from cell surface; yellow). Scale bar = 5 microns. K, L, Isolated cell-surface puncta. M, Raw synaptic fluorescence used for Imaris spot detection. N, Local fluorescence intensity maxima identified using automatic detection parameters (yellow spots). O, 3D rendering of puncta centers (from L) as spots. P, Q, Alignment of puncta 3D renderings and spots. Scale bar = 1 micron. R, Alignment of spots and signal enhanced fluorescence. S, T, Alignment of spots and raw fluorescence. Scale bar = 5 microns. U, Workflow summary. Courtesy of Alison L. Barth, Carnegie Mellon University.

研究人员通过使用iMaris呈现神经外缘进行了高通量突触定量，然后将点状分配给单个神经元进行定量分析。重要的是，他们能够设定特定的距离，以排除离神经元过程太远的任何东西。他们使用Imaris细丝示踪模块创建了将表面和细丝对象既结合的3D单元表面渲染。使用Imaris中的表面对象质心将点对象转换为“斑点”。

通过这种方法，研究人员能够检查数百个细胞，并在抑制如何在不同细胞之间分布着令人难以置信的多样性。分析表明，白蛋白的输入是躯体和树突的主要抑制源。根据Barth的说法，这些特别集中在主要的根尖树突上，这是以前从未观察到的分布。研究人员还使用Imaris创作了他们研究的细胞的非常引人注目的电影。

扩展分析

自执行这项工作以来，研究人员使用了Imaris生成的一些定量信息，参加了卡内基·梅隆大学（Carnegie Mellon University）的一项基于神经的黑客马拉松。由于Imaris提供了有关检测到的突触的大小，形状和强度的信息，因此研究人员希望找出此信息是否可以根据突触后点的荧光特性来定义突触输入。

“因为每个细胞都有很多点，所以我们永远无法手动进行这种类型的分析。”“在黑客马拉松期间，计算机科学家对数据进行了处理，以查看与其他输入相比，某些输入的形态外观与众不同。”

对于黑客马拉松来说，研究人员计算了超过150,000个突触，比在脑组织中进行的任何其他研究都要多。数据分析表明，可以根据其外观来区分不同类型的输入。

这部电影显示了来自少年小鼠体感皮质的5层锥体神经元，里面充满了dtomato，上面贴有fappost标记的突触。丘脑后内核的丘脑轴突用CFP标记。对丘脑皮质突触进行数字鉴定并渲染以显示输入在金字塔神经元的树突状乔木上的分布。卡内基·梅隆大学博士后研究员Ajit Ray博士收集的图像。

研究论文：Kuljis DA，Park E，Telmer CA，Lee J，Ackerman DS，Bruchez MP，Barth AL。基于荧光的定量突触分析针对细胞类型特异性连接组学。Eneuro。2019年10月31日; 6（5）：Eneuro.0193-19.2019。doi：10.1523/eneuro.0193-19.2019。PMID：31548370;PMCID：PMC6873163。