使用蜻蜓旋转磁盘共焦理解表观遗传的分子基础。

大家结束Dimova:揭露PRC2的表观遗传作用在他的实验室

表观遗传学是研究基因表达的传染性的修改不加密的基因组DNA,和出于这个原因,名叫(Epi)基因-(上图)遗传学。表观遗传学与化学修改染色质DNA或蛋白质。一个常见的表观遗传修饰是DNA甲基化。DNA甲基化是一个压抑的表观遗传特征正常发展的必要条件。

转录的控制对正常细胞分化至关重要。Polycomb集团(PcG)在开发过程中所需的蛋白质是细胞分化和作为转录阻遏物。有趣的是,DNA甲基化有一个意想不到的作用,确保正确的瞄准Polycomb压制性复合物的整个基因组染色质。

的他的实验室(MRC遗传学和分子医学研究所,爱丁堡大学)重点理解巩固基因调控的表观遗传机制在老鼠胚胎的发展。主要研究目标是更好地理解DNA甲基化之间的关系和Polycomb复杂:这两个系统如何协调维持发育基因沉默吗?

米实验室之前的研究显示,全球的DNA甲基化作用于Polycomb通过限制其沉积其目标网站[1,2]。进一步,表明重构表观遗传状态的老鼠胚胎干细胞,导致hypomethylated状态,诱发relocalisation Polycomb周边地区。更具体地说,Polycomb组件异常堆积在基因组区域,而pericentromeric异染色质变得hypomethylated (PCH)。PCH域包含主要卫星阵列串联重复序列在染色体动力学中起着基础性作用和基因组的稳定性,特别是在有丝分裂。pericentromeric异染色质域特征主要是由专制签名:赖氨酸9的tri-methylation组蛋白H3 (H3K9me3)。

他实验室的主要目标是识别如果Polycomb组件的再分配是一个被动或主动的过程在hypomethylated小鼠胚胎干细胞(制)。

大家结束Dimova(博士研究生/从米实验室研究员)承认,她是着迷的一致性Polycomb重定向到PCH系统。此外,Dimova补充说,”我非常兴奋能够看到relocalisation在活细胞中,是到目前为止已经完成了大部分的实验固定细胞。”

Dimova染色质读者结构开发用于Tuncay Baubec实验室现场成像实验[3]。这些构造相当有用,因为他们包含域识别特定组蛋白修饰。在这种情况下,表观遗传修饰分析是H3K27me3(组蛋白H3、修改赖氨酸27 -添加了三甲基)。H3K27me3由PRC2修改沉积(Polycomb专制复杂2)。

在表观遗传学分析的前沿,Dimova和米集团期望分析(生活)如何Polycomb relocalisation诱导表观遗传修饰。的质粒表达Cbx7(染色质的读者H3K27me3)融合GFP和成像蜻蜓超速的共焦将允许大家结束可以吗表观遗传修饰在活细胞。(图1)。

图1——最初的验证结果。可以观察到,Cbx7-GFP的表达(染色质组蛋白的读者3甲基化赖氨酸27融合GFP)控制和三重KO细胞之间是相似的。由于表达式具有可比性,因此最初的方法验证。A、B——活细胞成像和或蜻蜓。C, D——数据分析是由创建表面伊万里瓷器9.6。

如何在老鼠胚胎干细胞表观遗传修饰被测试吗?

实验室所采取的方法是引入上述构建的细胞没有任何功能性DNA甲基转移酶。计划介绍GFP-Cbx7构造DNA甲基转移酶的三重淘汰赛(TKO)制,细胞没有功能性DNA甲基转移酶(Dnmts)。因此,记者的修改或relocalisation将由组蛋白修饰而不是内生甲基化。重要的组蛋白修饰的relocalisation也可能是由DNA甲基化。

GFP-Cbx7以来最初的结果是令人兴奋的记者作为集群信号出现在DNA甲基转移酶KO细胞。因此,它表明可能有relocalisation Polycomb远离其常规网站和在这些集群。在这种情况下,结果将指出积极relocalisation Polycomb由DNA甲基化的损失。这个结果意味着一些PRC1/2模式动态重新分配在公司为了应对改变DNA甲基化状态,这也可能发生在小鼠早期发育。Dimova补充道,“我们还没有确认是否记者对应pericentric异染色质形成的集群”。

分析数据并执行实验生活,Dimova不得不克服一些挑战:

• 的显微镜探测器需要足够敏感图像与一个小记者的质粒的拷贝数量。
  • 我们的目标是能够想象信号而不干扰正常的细胞功能。
• 显微镜需要高效照明结合极度敏感的探测器。
  • 目标是激发荧光团和检测感兴趣的蛋白质不会引起任何光毒性或光漂白。
• 胚胎干细胞的形象,让他们的视野(公司的移动很多在文化)。
  • 目标是获得几个栈以足够的速度,分析数据所需的所有信息检索,和细胞领域的观点。
• 显微镜需要允许多个收购
  • 我们的目标是收集在相同的实验条件(使用相同的收购设置)同时为控制和突变细胞系。

Dimova承认和或蜻蜓提供所有的表观遗传修饰的重要功能,允许实时成像。蜻蜓的速度和灵敏度允许实时成像数据的收购公司。

“我更喜欢使用和或蜻蜓共焦显微镜获得这些延时图像旋转的圆盘,因为它能够给我解决我需要实时观察sub-nuclear事件发生。我也能够查看我的记者在整个细胞周期的进展。”

此外,Dimova解释说

“融合内置反褶积是一个优势,因为它会增加图像的分辨率”。

作为一个整体的评论和或蜻蜓:

“系统很好优化和自动使它非常容易获得大量的数据适合统计分析。”

Dimova的目标是分析pericentric异染色质的表观遗传修饰诱导Polycomb,和工作仍在进行中。“我们发现一个主要挑战是污点DNA的能力和保留染色质——局部信号”(例如,使用DNA染色剂不会影响染色质结构)。这个结果对Dimova至关重要的研究:确定甲基化的完全本地化的记者与pericentric异染色质(PCH)。

Pericentric时可以观察到异染色质与DAPI染色(或赫斯特)。然而,由于DAPI(赫斯特)是染料,插入DNA,他们似乎取代周围的染色质。使用和或的蜻蜓,Dimova意识到这种分析只能由live-cell成像。

现在,Dimova需要染色的异染色质分析本地化或relocalisation记者。如何克服障碍?这个计划是使用另一个染色质——读者(记者)设计Baubec实验室和染色pericentric异染色质和记者同时GFP-Cbx7。Dimova补充说,“我们目前的过程中使其兼容我们的细胞。”

作为一部动作片,我们等不及要看这个故事的下一章节,表观遗传修饰在公司的知识分子。祝你好运,大家结束和他实验室;请与我们保持联络的结果进行收集和分析!

引用

• 原,摩根大通Perricone,克里内斯特,刚建成时、Reichmann Youngson n。,铃木M。莱因哈特D。,Dunican科学博士,普兰德加斯特j。,Mjoseng H。,Ramsahoye b . H。怀特劳E。,Greally j . M。,亚当斯i R。比克摩尔w . a & Meehan水银血压计(2013)再分配的H3K27me3 DNA hypomethylation de-repression Polycomb目标基因的结果。基因组医学杂志14日,R25。
• 麦克劳林K。,Flyamer i M。,汤姆森j . P。,Mjoseng香港,舒克拉R。我,威廉姆森。格兰姆斯广义相对论伊林沃思r S。,亚当斯i R。彭宁斯j . S。他不R R。,比克摩尔w·A。(2019)DNA甲基化指导Polycomb-Dependent 3 d基因组重组在天真的多能性。细胞的报道,29日,1974 - 1985。
• 约翰R,正在Pfaendler R, Ambrosi C,一部年代,朱利安尼年代,布赖恩•E Sheahan TW,山墙,Schmolka N, Manzo M, Wirz J,樵夫C·冯·仅仅是C, Aebersold R,沃伊特P, Baubec T。(2020)ChromID识别蛋白在染色质interactome标志。生物科技Nat》。38 (6): 728 - 736。