使用共聚焦旋转圆盘显微镜了解听力障碍的分子基础

使用蜻蜓可视化毛细胞动态

在英国，五分之一的成年人是聋人或有不同程度的听力损失。听力障碍会导致沟通困难，并可能导致社会孤立和抑郁的增加。COVID-19大流行对听力损失患者的影响尤为严重，因为佩戴口罩和保持社交距离使沟通更加困难。除此之外，一些研究表明听力损失还有痴呆症，轻度听力损失可能会使患痴呆症的风险增加一倍，而严重听力损失的风险会增加到5倍(了解更多）.

听力损失有几个潜在的原因;这些因素包括年龄、噪音、遗传、疾病和某些类型的治疗药物。引起耳朵损伤的药物被称为“耳毒性”(耳毒性)，其中一类药物是氨基糖苷类抗生素。氨基糖苷类药物被用于治疗危及生命的细菌感染，如败血症和耐多药结核病，但作为一种不幸的副作用，它们会破坏内耳的感觉毛细胞，导致听力丧失和平衡障碍。

内耳的毛细胞之所以叫这个名字，是因为它们的顶端有一种被称为静纤毛的细毛状突起，可以对声音振动做出反应。毛细胞将静纤毛的机械运动转化为电信号，我们的大脑将其解释为声音(如语音和音乐)。在人类和其他哺乳动物中，毛细胞不能再生，因此一旦失去它们就永远无法恢复。因此，听力损失是不可逆的，因此，在这一领域的研究是非常重要的。

在本文中，我们介绍:

• 快速概述Andor蜻蜓共焦系统作为解决方案:
  • 成像细胞内转运;
  • 极化上皮细胞的研究。
• 研究重点:了解感觉毛细胞的细胞内运输

图1 -转pou4f3 GFP的斑马鱼后侧线毛细胞。毛细胞以青色表达绿色荧光蛋白(GFP)，以品红表达德州红庆大霉素(TRG)。将TRG添加到培养基中，幼虫保持在这个时间点(添加TRG后3分钟)，只有动纤毛和静纤毛标记有TRG。细胞用Andor Dragonfly成像。A)毛细胞堆的最大强度投影(MIP) B)毛细胞堆的三维旋转MIP和三维可视化的头发堆叠组装与Imaris软件。

用于极化上皮成像的Andor蜻蜓

极化上皮细胞的研究需要多种实验方法，其中光学显微镜起着重要作用。

为了可视化这些细胞的细胞内运输，成像系统必须允许温和的实时成像与高速图像采集相协调。具有特殊背景抑制的高灵敏度系统是必不可少的。此外，该系统应该在各种各样的尺度上提供成像，从亚细胞结构到组织、器官或生物水平(图1显示了活斑马鱼幼虫中毛细胞的成像)，这将使研究人员了解亚细胞动力学如何影响组织、器官或生物。

安多的蜻蜓包括特殊的功能，是极化上皮成像的理想选择。其高采集速度和实时3D渲染允许快速成像和可视化而不损失分辨率。该系统可实现高达每秒400帧的成像。对于器官或生物体内这些细胞的概览，大视野结合Borealis均匀照明提供无缝拼接，允许在每个尺度上实时可视化。

我们问凯尼恩博士，为什么安多的蜻蜓是理解感觉毛细胞细胞内运输的重要工具?

凯尼恩博士回答说:

＂“安多蜻蜓”对于这项研究(毛细胞中的转运研究)是无价的，特别是这些氨基糖苷在斑马鱼毛细胞中的转运发生在很短的时间内，需要快速的图像采集．＂

“此外，用于识别细胞内隔间的染料特别容易发生光漂白，使用蜻蜓会大大减少这一点。”

图2 -有机型小鼠耳蜗培养的外毛细胞。毛细胞用LysoTracker绿色标记为青色，德克萨斯红庆大霉素标记为洋红色。细胞用Andor Dragonfly成像。使用Imaris软件对毛细胞进行三维旋转。

研究重点:理解感觉毛细胞的细胞内转运

艾玛·凯尼恩博士是由英国皇家聋人协会．凯尼恩博士就职于“kro/理查森实验室在苏塞克斯大学生命科学学院神经科学系．实验室对内耳如何工作和发育很感兴趣。主要目标是解开耳聋和平衡障碍的主要原因。

凯尼恩博士的研究集中在拯救生命的耳毒性药物如何导致耳聋和平衡障碍。更具体地说，她专注于氨基糖苷类抗生素(如庆大霉素，卡那霉素)损害感觉毛细胞的机制。凯尼恩博士的研究目的是保护毛细胞免受这些耳毒素的侵害，并保护需要这些药物的患者的听力。

凯尼恩博士他的研究特别感兴趣的是感觉毛细胞的细胞内运输，以及氨基糖苷类一旦进入细胞是如何运输的。为了回答她的问题，博士凯尼恩将一个荧光团(德州红)偶联到不同的氨基糖苷上。然后使用荧光显微镜在斑马鱼侧线的感觉毛细胞和小鼠耳蜗培养中跟踪这些细胞。斑马鱼的侧线含有类似于哺乳动物内耳(耳蜗)中的毛细胞，但由于它们位于鱼的表面，因此可以在活体动物中使用荧光显微镜对它们进行成像，而无需额外的组织准备。斑马鱼侧线和小鼠耳蜗培养是这项研究的互补模型，但它们也存在挑战:

• 细胞内运输的可视化需要实时成像和具有高空间和时间分辨率的快速图像采集。
• 成像需要在弱光下进行，以防止光毒性和光漂白。
• 抗生素细胞内位置的精确可视化需要高背景排斥反应和敏感性。

凯尼恩博士的实验涉及德州红共轭庆大霉素在毛细胞中的荧光共聚焦成像活斑马鱼幼体或小鼠耳蜗培养物。毛细胞用针对细胞内间隔的染料标记，并在设定的时间点拍摄图像。在斑马鱼模型中，毛细胞每5分钟成像一次，持续80分钟(图1)，而在小鼠培养中，图像是在2、4、16和24小时拍摄的(图2和3)。这些实验可以跟踪庆大霉素的运动，并可视化它们可能被运输到细胞内的哪个区室以及何时运输。

图4 -通过有机型小鼠耳蜗培养物外毛细胞的正交横切面。为了分析毛细胞，Kenyon博士利用Imaris软件的正交视图，将德州红庆大霉素在所有平面上的分布与LysoTracker绿色庆大霉素的分布进行了比较。毛细胞用LysoTracker绿色标记为青色，德克萨斯红庆大霉素标记为洋红色。细胞用Andor Dragonfly成像。

我们已经问过Dr。凯尼恩博士最后一个关于和或蜻蜓：

＂我喜欢系统启动和关闭的速度，使其成为飞行实验的理想选择．＂

该项目资助至2021年底。

• 凯尼恩博士目的探讨感觉毛细胞的胞内转运途径。具体来说，氨基糖苷类被贩卖的机制。
• 他们的期望是找出可以保护毛细胞免受耳毒性药物伤害的途径。最终的目标是促进药物的发展它们对治疗感染有效，但不会增加听力损失和可能相关的痴呆症的风险。

参考文献

1. 肯扬,2陈焕祯．et al。一系列毛细胞MET通道阻滞剂的鉴定，可防止氨基糖苷诱导的耳毒性JCI洞察力。(2021) 6 (7):e145704
2. O ' reilly M。et al .,新系列卡维地洛衍生物的设计、合成和生物学评价，通过阻断机电传感器通道保护感觉毛细胞免受氨基糖苷诱导的损伤地中海,化学。2019, 62,11,5312 - 5329
3. 肯扬,2陈焕祯．et al。离子通道调节剂的鉴定，保护防止氨基糖苷诱导的毛细胞死亡JCI洞察力。(2017);2 (24): e96773。
4. 布朗M。, (2017)12个原因为什么你的下一个共焦应该是蜻蜓．
5. Kenyon Instagram账号-实验室工作的照片