使用共聚焦显微镜了解细胞分裂和癌症发展

细胞分裂是生命所必需的，这一过程中的错误会导致细胞死亡或与癌症发展相关的基因组不稳定。然而,细胞增殖是怎样的被监管的仍然没有完全理解．

简而言之，体细胞分裂(有丝分裂)是一个细胞分裂产生两个基因完全相同的子细胞的过程。在这个过程中的关键角色是中心体、微管和染色体。这些结构以一种精心安排和严格调节的方式连接起来，以快速完成忠实的染色体分离。成功的有丝分裂是通过激酶、磷酸酶和蛋白水解的有序相互作用实现的。

马球必需有丝分裂激酶是在黑腹果蝇(Llamazares et al.， 1991)，后来发现在所有真核生物王国中都是保守的。在哺乳动物细胞中描述的第一个马球同源物是马球样激酶(PLK1)，它是细胞分裂的中心调节因子。Plk1激酶作用于有丝分裂的几个关键点，是它的一些功能:

• 中心体成熟，通过激活中心体周围物质向中心体的募集。
• 双极纺锤体组装和维护，通过确保适当的双向染色体附着，从而确保染色体分离的保真度
• 调节有丝分裂退出，通过磷酸化关键靶分子促进及时的胞质分裂

电影1-观察细胞分裂(有丝分裂)的实时成像安多台式共焦- BC43．哺乳动物细胞用BC43共聚焦成像模式成像超过6小时。每个时间点成像8个独立位置，每个位置获取3个通道和15个Z层。电影展示了8种姿势中的一种。通过分析微管(蓝色)和DNA(黄色)可以观察到细胞进入和退出有丝分裂。(黄色- DNA，蓝色-微管，红色- Sir肌动蛋白)。图片来源:Ines Baião-Santos， Álvaro塔瓦雷斯-阿尔加维大学，Claudia Florindo - Andor技术。

另一个与控制细胞增殖有关的蛋白质家族是MOB1-like蛋白质家族。mob1样蛋白(mob)是激酶激活剂，与PLK激酶一样，在整个真核生物王国中都是保守的。PLK1和MOB1在细胞周期中都有动态定位。两者都位于有丝分裂开始时的中心体和细胞质分裂前的中体。MOB1定位是关键细胞动力学调控因子的特征。事实上，PLK1和MOB1对于细胞质分裂的完成都是必不可少的。

电影2-早期分裂的实时成像果蝇胚胎与Andor台式共焦．使用BC43共聚焦成像方式对果蝇合胞体胚胎进行成像，视频为3个z -stack的MIP，显示为青色GFP-polo和黄色Histone 2B-mcherry。使用GFP-polo作为标记，可以动态可视化显示有丝分裂的中心体(分裂早期)以及中心体和纺锤体(从前中期到后期)。GFP-Histone 2B允许表型地处理有丝分裂中的DNA，并访问(以及其他特征)DNA缺失分离。(青色-GFP polo，黄色-组蛋白2B-RFP)。图片来源:Ines Baião-Santos， Álvaro塔瓦雷斯-阿尔加维大学。

MOB1在两种细胞通路中起作用有丝分裂退出网络(MEN)，在酵母中河马通路在后生动物。MEN控制有丝分裂退出的及时执行。Hippo通路控制细胞周期和组织生长(器官大小控制和再生)之间的协调。值得注意的是，Hippo信号级联的所有核心成分都被证明是肿瘤抑制基因，MOB1也不例外。Hippo通路组分，特别是MOB1的去调控或功能受损导致肿瘤的发生。

图1哺乳动物细胞中期成像安多台式共焦- BC43．采用宽视场成像方法对固定的哺乳动物细胞进行成像。该图像显示了在这个实验中获得的20个独立位置中的一个。我们为每个位置获得了两个独立的通道，覆盖范围为15µm。反褶积选项在协议中被激活。在imaris中对图像进行进一步处理，给出了表面渲染图像的MIP。(黄色-微管，红色- dna)。图片来源Ines Baião-Santos， Álvaro塔瓦雷斯-阿尔加维大学，Claudia Florindo - Andor技术。

细胞生物学研究鉴定和审查基因的未知分子功能促进了新的知识。所获得的知识可以(而且经常)用于应用科学，以改善人类健康(例如，通过促进新疗法的发展)。

值得注意的是，一些关键的细胞周期调节器目前正在进行针对癌症治疗(以及其他疾病)的积极临床试验。PLK1基因就是这样一个例子。美国国立卫生研究院临床试验数据库目前显示了27项研究，分析了PLK1抑制剂作为癌症治疗剂或PLK1作为癌症预后标志物的疗效。

综上所述，细胞周期的完全调控机制尚不清楚，分子功能也不完全肿瘤抑制因子MOB1和致癌基因PLK1．因此，更好地了解细胞周期调控机制无疑将为未来的癌症治疗提供更多的见解。

应用案例:塔瓦雷斯实验室-使用细胞生物学来揭示癌症相关基因的功能

阿尔瓦罗·塔瓦雷斯他是阿尔加维大学细胞周期和癌症生物学实验室的组长。塔瓦雷斯实验室背后的潜在主题是有丝分裂细胞分裂的基本生物学，特别是规范的方面双极有丝分裂纺锤体的形成和中心体与胞质分裂的联系．

实验室的另一个重点领域是研究蛋白质的功能，这些蛋白质驱动其他非直接有丝分裂细胞的功能，例如，细胞死亡，细胞迁移或不受控制的细胞增殖．这个实验室的目标是了解这些细胞过程的修改如何促进正常细胞转化为癌细胞．

图2 -塔瓦雷斯实验室照片．从左至右丹妮拉·西尔维斯特，Inês卢萨，伊内斯Baião-Santos，胡安·马拉沃和Álvaro塔瓦雷斯(组长)。

为了实现其研究目标，该实验室利用黑腹果蝇和人类培养的细胞，结合生化、遗传和细胞学技术。在实验室中使用的一些技术的例子有:

• 果蝇正向和反向遗传，
• CRISPR/Cas9基因组编辑技术，
• 蛋白质-蛋白质相互作用分析，和
• 多维共聚焦和宽视场成像。

塔瓦雷斯教授使用了新的安多台式共焦成像仪- BC43在他的研究中，我们问了他在用这个系统成像细胞分裂时的经验:

＂它非常紧凑，使用起来毫不费力。我发现Andor台式电脑为拍摄活细胞提供了高质量的成像。该系统能够在固定或活样品中产生非凡的结果．＂

图3 -共聚焦成像方式Andor台式共焦用来成像果蝇胚胎的早期分裂．A)所呈现的图像是6个成像场拼接的结果，Z范围为50µm。B)放大A)中白色方块内突出显示的区域显示了早期果蝇胚胎有丝分裂纺锤体的细节。(蓝色微管，黄色中心体，品红dna)。图片来源:Ines Baião-Santos， Álvaro Tavares - universversidade do Algarve, Claudia Florindo - Andor technologies。

塔瓦雷斯实验室的研究重点

细胞分裂的准确性是维持细胞倍性和基因组稳定性的关键。它依赖于细胞分裂轴的正确建立，细胞分裂轴受细胞环境及其固有极性的控制。塔瓦雷斯实验室通过两个独立的研究方向探讨了高真核细胞中细胞增殖是如何被调节的:1)有丝分裂纺锤体组装和功能;2)分析mob样蛋白在细胞增殖中的中心角色。

图4-观察哺乳动物细胞分裂Andor台式共焦．哺乳动物细胞用BC43共聚焦成像模式成像4小时以上。在每个时间点，4个独立位置成像，每个位置获得3个通道和15个Z堆栈。我们从4个独立的位置之一展示了一个细胞通过四个有丝分裂阶段的电影静止:前期(面板a)，中期(面板B)，后期(面板C)和末期(面板D)。(黄色微管，青色- DNA，时间h:分钟:秒:毫秒)。图片来源:Ines Baião-Santos和Álvaro塔瓦雷斯，阿尔加维大学，Claudia Florindo, Andor Technology。

研究线1 -有丝分裂纺锤体组装和功能

中心体建立有丝分裂纺锤极，中心体数量或结构组织缺陷可导致染色体分离异常。高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶polo样激酶1 (PLK1)在具有聚焦极的功能双极纺锤体的组装中起着重要作用。

Tavares教授首次发现PLK1 (polo)是中心体成熟和细胞质分裂所必需的(Llamazares et al.， 1991)。这种激酶被证明是细胞周期进程的关键调节因子，并在科学界引起了极大的兴趣。尽管PLK1一直是密集研究的对象，但其调节纺锤极形成的机制仍然是详细的。此外，PLK1激酶被发现是一种致癌基因，目前正在几个临床试验中进行研究，作为癌症治疗或预后标志物的一个有前途的靶点。

细胞周期和癌症生物学实验室旨在更深入地了解关键的细胞周期调节因子，如PLK1。最终目标是为开发新的和改进的抗癌疗法做出贡献。

图5- PLK1抑制会损害哺乳动物细胞分裂的不同阶段。哺乳动物细胞采用BC43共聚焦成像模式，成像条件与图4相同。成像开始6分钟后(B组)向细胞中添加PLK1抑制剂(BI-2536, Selleck)。白色箭头显示添加PLK1抑制剂时正在完成细胞分裂的细胞。PLK1在发病后期(图B)抑制诱导卵裂沟的消退，并导致脱落失败(图D)，产生四倍体双核细胞(图E-F)和多余的中心体(肿瘤发展的一个共同特征)。强调PLK1在后期发病后的作用(作为细胞质分裂的调节因子)。青色箭头显示添加PLK1抑制剂时正在启动有丝分裂的细胞(a - b图)。两个中心体(见图C)在核膜破裂时未能建立双极纺锤体(图D)，并坍缩形成单极纺锤体(图E)。没有适当的双极附着，细胞在有丝分裂中停滞(图F)，并可能通过有丝分裂滑移进行有丝分裂或变成多倍体。(强调PLK1在中心体功能和双极纺锤体的建立和维持中的作用)(黄色微管，青色- DNA，时间h:分钟:秒:毫秒)。图片来源:Ines Baião-Santos和Álvaro塔瓦雷斯，阿尔加维大学，Claudia Florindo, Andor Technology。

分析有丝分裂纺锤体关键调控因子功能的重要性的一个例子是实验室对纺锤体基因所做的工作。纺锤体是染色体正确附着于纺锤微管和染色体分离所必需的。紫杉醇是一种稳定微管的药物，通过这样做，损害细胞分裂。它被广泛用于癌症治疗。然而，对治疗的耐药性以及它的高毒性和次要影响是使用这种化学品的重要问题。

与Hassan Bousbaa博士(CESPU，葡萄牙)合作，测试了一种使用细长抑制剂和紫杉醇作为抗癌药物的联合方法。研究结果令人鼓舞，表明细轴抑制剂和微管稳定药物的联合作用加剧了低剂量紫杉醇治疗的癌细胞的细胞死亡反应(Silva et al.， 2017)。

研究线2 - moblike蛋白:细胞增殖的中心角色

Tavares教授实验室的第二个重点领域是moblike蛋白在细胞增殖中的功能。moblike蛋白是激酶伙伴，在细胞周期的不同阶段发挥作用。例如，它们是Hippo信号通路的关键组成部分，这是一种协调细胞增殖和器官生长的通路。

该团队已经证明，MOB1通过促进微管不稳定，在细胞分裂的最后阶段，即细胞质分裂中是必需的(Florindo et al.， 2012)。

在与Helena Soares博士(IGC, Portugal)的合作中，利用纤毛原生动物进一步研究了MOB1的向心功能四膜虫termophila．令人兴奋的结果表明，MOB1是一种固有的细胞极性标记，是该生物中描述的第一个分子极性标记(Tavares et al.， 2012)。就像在哺乳动物细胞中，MOB1的下调四膜虫导致执行细胞质分裂失败。结合哺乳动物细胞的结果，在细胞质分裂后，MOB1的缺乏增加了细胞的活力，并诱导G1期延长的中心粒分离，该小组提出了MOB1是细胞分裂后重新获得完全期间极性所必需的假设。在这方面，值得注意的是，在果蝇和小鼠中，MOB1的下调都会导致肿瘤的形成。

电影3 -通过EB1-GFP跟踪微管的生长尖端来分析微管动力学。表达EB1-GFP的Hela细胞用BC43在共聚焦模式下以每秒2帧的帧率成像6分钟。可以清楚地观察到微管和末端尖从细胞有丝分裂的中心体中生长出来。(注意:1-有丝分裂失败可能是由微管动力学损伤引起的，2-一些癌症治疗直接针对微管动力学，例如紫杉醇)。图片来源Ines Baião-Santos， Álvaro塔瓦雷斯-阿尔加维大学，Claudia Florindo - Andor技术。

重要的是，moblike蛋白在真核生物王国中是高度保守的。这方面的一个例子是，从老鼠到人类的100%蛋白质同一性，这表明了一种必不可少的保守功能。在进化过程中，它经常发现基因复制事件从不太复杂的生物到更复杂的生物。暴徒也不例外，在哺乳动物中，有7个类似暴徒的基因。

还有几个问题有待回答:

• 其他类mobs基因的功能是什么?
• 所有的MOB基因都是肿瘤抑制基因吗?
• MOB基因发挥细胞增殖调节功能的分子机制是什么?

塔瓦雷斯实验室正试图回答这些有关细胞分裂的基本问题。这些问题的答案无疑将为癌症治疗的新发展打开大门。

最后，Tavares教授告诉我们，这些研究的执行很大程度上依赖于显微镜技术。我们已经询问过他对BC43性能的最终评价，他的回复是:

“Andor台式共焦擅长获得高质量的分裂细胞活体成像结果。我发现它有点大:体积小，图像质量大。”

使用的关键词术语表

参考书目

• 弗洛林多C. (2021)介绍新型安多台式共聚焦显微镜- BC43
• Florindo C. (2021) Andor台式共聚焦(BC43)在细胞周期和癌症研究中的优势
• 弗洛林多C.， Perdigão J.， Fesquet D.， Schiebel E.， Pines J.和Tavares A.A. (2012)人Mob1蛋白通过控制微管稳定性来实现胞质分裂。细胞科学．125: 3085 - 3090。
• Llamazares S.， Moreira A.， Tavares A.， Girdham C.， Spruce b.a.， Gonzalez C.， Karess r.e.， Glover d.m.，和Sunkel C.E.(1991)。polo编码果蝇有丝分裂所需的蛋白激酶同源物。基因和开发。5：2153 - 2165。
• 席尔瓦点A.， Ribeiro N.， Lima T.， Andrade C.。， Diogo V。，特谢拉J。C。，塔瓦雷斯A。，瓦斯康塞洛斯m.h。， Bousbaa H. (2017)抑制细长延迟有丝分裂退出和加剧细胞死亡反应的癌细胞治疗低剂量紫杉醇。癌症的信394:33-42。
• Tavares A.， Gonçalves J.， Florindo C.， Tavares A.， Soares H. (2012)Mob1:为正确的细胞分裂定义细胞极性。细胞科学。125: 516 - 527。
• 细胞周期与癌症生物学实验室-网站链接