使用共聚焦显微镜研究发育生物学的基本阶段

在本案例研究中，我们概述了甲状腺激素研究中的科学和技术挑战。我们将介绍BC43，新型台式共焦并展示BC43如何帮助克服发育生物学研究中的挑战。

本文分为三个部分:

• Andor台式共聚焦显微镜- BC43;
• 甲状腺激素在变态发育中的作用综述
• 应用案例研究:发育和变态的分子机制研究。

图一-用BC43共聚焦成像模式成像扁鱼头。用乙酰化微管蛋白染色显示神经元(黄色)，用抗肌球蛋白重链血清(青色)染色显示横纹肌。这张图片展示了单个轴突(黄色)的高细节和分辨率。图像由安多台式共焦- BC43使用多瓦采集，蒙太奇和长工作距离40X物镜。获得48块瓷砖，有175片，Z范围为330µm，获得的结果进行反卷积和缝合。可以观察到完美的拼接。图片由Imaris进一步渲染(图片来源:Marco Campinho, CBMR university do Algarve和Claudia Florindo, Andor Technology)

介绍安多台式共焦- BC43

BC43安多的新产品是即插即用的高速共焦系统而且是一个台式共焦成像它以独特的价格提供卓越的成像效果。使用BC43，用户可以根据实验目标选择不同的成像方式。成像方式包括:

• 高质量共聚焦荧光成像
• 宽视野荧光成像
• 无激光成像(透射光)

BC43是多种生命科学应用的理想系统。万博电脑网页版登录其中一个应用程序是发育生物学．BC43跨越了发育生物学家三维世界的成像挑战。

研究人员可以很容易地研究从第一轮细胞分裂到整个生物体的发育过程。它提供了快速、高分辨率的生长模式生物成像。此外，它比传统的荧光显微镜成像更深，成像速度比传统的共聚焦系统快10倍。

电影1 -斑马鱼血管发育的实况影像。转基因斑马鱼血管发育的实时图像(以青色显示)与灰色的DPC(差分相位对比)相结合。成像从28hpf到36hpf。图像采集采用共聚焦成像方式安多共焦自旋盘- BC43。成像程序启动了延时和蒙太奇。在每个时间点采集了9块瓷砖，对于共聚焦和DPC通道，覆盖范围为633µm。使用Imaris软件对得到的图像进行反卷积和缝合。(图片来源:Marco Campinho universversidade do Algarve和Claudia Florindo, Andor Technology)。

在发育生物学中遇到的主要挑战以及如何通过Andor台式共焦BC43解决这些挑战总结在下表中:

马尔科·坎皮尼奥博士(阿尔加维大学研究组组长)是一名发育生物学家，他的研究重点是变态的分子机制。坎皮尼奥博士的具体目标是了解甲状腺激素是如何控制这一发育过程的。在他的研究中，他描绘了大型模式生物(斑马和比目鱼)的图像。

我们请坎皮尼奥博士测试安多台式共焦- BC43看看它在这些发育生物学研究中是否有效。在测试了我们的系统后，Campinho博士说:

“在过去的十年里，我一直在使用大品牌的宽视场、点扫描仪和光片显微镜进行实时成像。昨天，我只用了30分钟就为24小时内的活体成像准备了8个胚胎。这是我职业生涯中经历过的最快、最简单的方式。我真的很喜欢BC43系统。”

继续阅读，以掌握目前在变态分子机制的研究和用于理解这一基本发育阶段的技术。

图2 -处于发育高潮的全身斑马鱼。免疫标记神经元(抗huc /D血清，黄色)和胶质细胞(抗zrf血清，品红)后，斑马鱼后脑在48hpf处的最大投影。细胞核用DAPI(青色)标记。图像由安多台式共焦- BC43使用多个瓷砖获取和蒙太奇。30个瓦片组成图像，每个瓦片有175个切片，在370毫米Z范围内。(图片来源:Marco Campinho Universidade do Algarve)

甲状腺激素在变态中的作用综述

激素是调节所有多细胞生物的基本分子。激素可以被描述为由内分泌系统产生和分泌的“信使分子”，控制整个有机体的内稳态。内分泌系统由许多腺体组成;每一种都会产生特定的激素。甲状腺是内分泌系统的腺体之一。

甲状腺产生T4激素(甲状腺激素的前体)。T4会发生局部活化，产生T3(活跃的甲状腺激素)。甲状腺激素在脊椎动物生理中的功能在从胚胎发育到成年稳态的所有生命阶段都具有重要意义。

在依赖甲状腺激素的各种发育作用中，人脑的发育尤为突出。孕妇循环中的甲状腺激素水平低会导致新生儿严重的神经缺陷。其他一些疾病也与甲状腺系统失调有关，如格雷夫斯病、桥本甲状腺炎，最近，在临床抑郁症中的作用越来越明显。

甲状腺激素对脊椎动物的发育和生理十分重要;它的发育作用首先在无尾猿两栖动物的变态中确立(Allen, 1925)。进一步的研究表明，与无尾鱼一样，T3对硬骨鱼(硬骨鱼)的变态至关重要(Inui and Miwa, 1985)。最近，坎皮尼奥实验室证明了这一点T3是胚胎发育的重要调节因子从鱼类到哺乳动物(Campinho等, 2014)。

现代研究已经证实甲状腺激素是发育的关键调节因子。然而，还需要进行更多的研究来充分掌握T3发育功能的调控和细微差别。由于T3甲状腺激素对脊椎动物的整体发育和稳态有如此大的影响，很明显，更好地了解T3的功能作为一个整体将允许发展治疗导向的研究，这将有助于减轻与T3相关疾病相关的负担。

图3 -用BC43成像比目鱼。变态高潮阶段的比目鱼神经元标记用乙酰化微管蛋白染色(青色)，横纹肌肌球蛋白重链染色(黄色)。图像由安多台式共焦- BC43使用多个瓷砖获取和蒙太奇。获取了6个瓦片来组成图像，每个瓦片有175片，Z范围为521µm。图像进一步渲染与Imaris。(图片来源:Marco Campinho universversidade do Algarve和Claudia Florindo, Andor Technology)。

发育生物学中的应用案例-发育和变态的分子机制研究

坎皮尼奥实验室对了解脊椎动物从胚胎发育到变态发育的细胞和分子基础感兴趣。鉴于T3在发育(包括胚胎发育和变态)中的广泛作用，实验室决定将研究重点放在甲状腺激素的分子功能上。为了实现研究目标，实验室使用斑马鱼和比目鱼作为模式生物。

图4 - Marco Campinho组长(左)和Andre Andrade博士候选人(右)在实验室里．

目前，实验室主要有两个正在进行的研究项目:

1) T3激素在斑马鱼神经发育过程中是如何产生细胞多样性的?

了解T3在斑马鱼神经发育中的分子机制，将推动对T3信号传导的整体分子和细胞机制的认识。

坎皮尼奥实验室已经表明，母体来源的T3是必不可少的，负责产生必要的细胞多样性，从而促进一个功能齐全的中枢神经系统的发展(Campinho等2014)。该实验室利用斑马鱼开发了首个艾伦-赫恩顿-达德利综合征的脊椎动物模型。重要的是，鱼模型允许拟表型(到模仿)在人类病人身上观察到的神经系统症状。

未来，实验室的目标是进一步开发斑马鱼T3转运体和受体功能丧失突变体;并期望从这些研究中获得的知识将有助于更深入地了解t3相关综合征。

图5 -斑马鱼的后脑。图像显示24小时斑马鱼后脑的双荧光原位杂交。在来自notch信号通路的黄色- δ A和在青色-甲状腺受体(thra)中。图像是139个堆栈的最大强度投影，覆盖187毫米深度的范围。图像由安多台式共焦- BC43。图片来自马尔科·坎皮尼奥，阿尔加维大学。

2)比目鱼的变态如何导致不对称脊椎动物的发展?

坎皮尼奥研究小组还专注于了解变态的基本机制。

使用比目鱼Solea senegalensis,实验室重点研究了驱动非对称变质发育的机制。该小组能够揭示比目鱼不对称变形发育的分子和细胞机制，其中一只眼睛迁移到头部的另一侧是不对称T3信号和骨化的结果(Campinho et al.， 2018)。

总的来说，坎皮尼奥实验室的目标是解决驱动甲状腺激素调节脊椎动物发育的细胞和遗传机制。具体来说，实验室的目标是:

• T3信号转译与人类疾病的相关性
• 形态发生的基本机制。

毫不奇怪，实验室使用各种分子和成像技术来实现目标，包括:1)斑马鱼转基因和CRISPR/Cas9遗传模型，2)药理学方法，3)组学和先进的显微镜技术。

该小组一直在使用BC43成像系统对发育中的斑马鱼胚胎进行长期(40小时)活体成像，并开发清除技术，以实现变质比目鱼幼虫的全装高分辨率成像。Campinho博士说

“在显微镜方面，我们必须克服几个复杂的技术障碍。即在变质时给予大尺寸的待成像样品(1-1.7毫米厚度)。”

我们请Campinho博士就测试我们的新安多台式共焦- BC43因为他在甲状腺激素调节方面的研究：

“Andor旋转圆盘技术提供了必要的显微镜技术，允许超越手头的技术挑战。”

非常感谢Campinho医生的反馈。我们期待看到你们更多精彩的影像和有趣的科学研究。

参考书目

• 艾伦,BM。甲状腺和脑下垂体切除对无尾猿肢体发育的影响。《实验动物学杂志》1925;42:13-30。
• 坎皮尼奥，MA, Saraiva, J, Florindo, C和Power, DM。母体甲状腺激素对斑马鱼的神经发育至关重要。Mol Endocrinol 2014;28:1136 - 1144。
• 坎皮尼奥，MA，席尔瓦，N，马丁斯，GG，安乔斯，L，弗洛林多，C，罗曼-帕迪拉，J，加西亚-切加拉，A，洛罗，B，曼查多，M和Power, DM。甲状腺激素调节的非对称反应中心与比目鱼变形过程中的眼迁移相关．2018年科学报告;8:12267。
• Inui, Y和Miwa, S。甲状腺激素诱导比目鱼幼虫变态。通用补偿证书1985;60:450 - 454。