沃兰实验室和成像FCS

在单分子水平上研究细胞

超分辨率显微术通过揭示之前隐藏在衍射极限之下的结构信息和相互作用，帮助我们对细胞生物学的基础有了更深入的了解。荧光相关光谱(FCS)是另一种强大的技术，已被用于确定细胞过程的时间动态单分子灵敏度。这两种技术被用来提供关于细胞物理化学特性的丰富信息，但通常需要相互排斥的实验策略，以牺牲另一个为代价来优化空间或时间分辨率。通过在同一个实验中同时获取空间信息和时间动态，有可能提高对复杂细胞过程的理解。如何成功地将这些技术结合成一个综合的方法是Thorsten Wohland教授和他在新加坡国立大学CBIS的同事一直致力于实现的目标。这些努力的结果已发表在他们最近的论文自然通讯”同时时空超分辨率和多参数荧光显微镜(Sankaran等人，2021年)。

结合时空超分辨率和多参数荧光显微镜

从单一图像堆栈中获得多个参数的基石——从FCS自相关中获得的迁移率，从FCS扩散定律中获得的膜组织，从数量和亮度分析中获得的oligoligization (N&B)，以及从超分辨率径向波动(SRRF)中获得的超分辨结构——是一种后处理策略，其中原始获取的数据被以一种适合于报告结构和动力学的四种不同技术的方式重新利用。使用图形处理单元(gpu)进行计算，使多参数后处理分析成为可能，因为这导致处理时间至少提高了10倍。

通过采用这种重新定位的策略，Wohland实验室研究了两种不同生物分子的结构和动态:一种是Lifeact——一种肌动蛋白结合多肽，一种是表皮生长因子受体(EGFR)——一种参与细胞信号传递并与多种癌症有关的蛋白质。来自FCS的Lifeact扩散信息使得从Lifeact SRRF图像中去除结构工件成为可能。在EGFR的情况下，多参数研究表明，EGFR的定位主要由EGFR之间和EGFR-细胞膜相互作用决定，与EGFR-肌动蛋白相互作用无关。

使用每一个单一的原始数据堆栈来获得多个生物物理参数提供了许多独特的优势。首先，这减少了需要准备的样品数量和实验室中需要进行的实验，从而消除了多个实验中样品可变性的影响。第二，通过同时获取同一样本的高分辨率时空信息，可以获得细胞的结构和动态特性之间的相关信息。

什么显微镜系统用于组合超分辨率和FCS?

精确测量FCS和许多超分辨率显微镜所涉及的荧光强度需要高灵敏度探测器。多年来这一直是EMCCD相机，比如安铎iXon EMCCD系列．除了高灵敏度外，与一般成像实验中常见的sCMOS相机相比，这些传感器具有一致的行为。近年来，新的背光sCMOS传感器出现在市场上，在灵敏度上比以前的sCMOS型号有了进一步的提高(尽管在低光条件下仍未达到emccd的水平)，并且在传感器均匀性方面也有了一些改进。Wohland实验室使用了iXon EMCCD摄像机和Sona-11背景sCMOS进行FCS研究。Sona相机提供了非常大的传感器尺寸，对角线可达32mm，而iXon EMCCD相机在较小的视野范围内提供了优越的灵敏度。虽然没有一种相机可以完美地适合所有的实验，但这使得相机可以被选择以适应实验的特定需求。

Thorsten Wohland教授就这一主题举办了一次网络研讨会。你可以查看它在这里．

成像FCS使所有TIRF和LSM用户都很容易

沃兰研究小组的目标是让更广泛的科学界更容易使用FCS。他们做到这一点的方法之一是开发易于使用的数据分析工具，如ImageJ/Fiji的Imaging FCS插件。作为一名实验者，有多少次你通过数据分析却发现测量不起作用?斐济插件不仅仅是一个数据分析工具，它还可以作为一个图像采集和校准软件，在测量过程中可以显示实时相关功能，因此在实验过程中可以立即向实验人员提供反馈，而不需要专门的硬件，因为所有传入的数据都通过CPU/GPU实时处理。来自所有像素的相关信息提供了另一个维度来探测样本上复杂的动态，否则不可能仅通过观看强度视频来判断。

这种实时方法改进了数据采集工作流，提高了生产率和可重复性。考虑到先进仪器的能力和单分子水平的生物物理参数观测任务，光学对准是获得最准确和精确信息的主要瓶颈就不足为奇了。通过优化每个像素的相关函数，可以在几分钟内开发出用于全反射(TIRF)和光片显微镜(LSM)的临界角度和聚焦的实时对准工具。在多色图像分配器实验中，它允许对齐不同波长通道的像素。值得注意的是，随着特定显微镜控制的加入，这些实现可以很容易地将荧光波动引入自动在线反馈显微镜的领域。该软件支持一些最流行的EMCCD和sCMOS，包括Andor iXon (860, 897, 888)而且Sona系列(11和6.5)．

更多关于沃兰实验室的信息

你可以找到更多关于沃兰实验室的研究和FCS插入在这里．

选定的出版物

1. Sankaran, J。et al。同时时空超分辨率和多参数荧光显微镜。Commun。121 - 14(2021)。
2. Gupta, A.， Muralidharan, S.， Torta, F.， Wenk, m.r. & Wohland, T.长酰基链神经酰胺调控膜外小叶动力学中胆固醇和细胞骨架依赖性。Biophys。学报- Biomembr。1862183153(2020)。
3. Macháň， R.， Foo, Y. H. & Wohland, T. FCS和FRAP的等价性:同步脂膜测量。J。111, 152 - 161(2016)。
4. 黄雪梅，黄雪梅，黄雪梅。表皮生长因子受体在静息状态和配体结合状态下的质膜组织。J。109, 1925 - 1936(2015)。
5. Krieger, j·W。et al。活细胞和生物体的成像荧光(交叉)相关光谱。Protoc。10, 1948 - 1974(2015)。
6. 成像荧光涨落光谱:定量生物成像的新工具。启。化学。65, 225 - 248(2014)。
7. 桑卡兰，J, Bag, N, Kraut, R. S. & Wohland, T.基于相机的荧光相关光谱测量的精度和精确度。化学。85, 3948 - 3954(2013)。
8. 辛格,a P。et al。基于光片的荧光相关光谱二维阵列探测器的性能。表达218652(2013)。
9. Sankaran, J.， Shi, X.， Ho, L. Y.， Stelzer, E. H. K. & Wohland, T. ImFCS:用于成像FCS数据分析和可视化的软件。表达1825468(2010)。
10. 桑卡兰，马娜，郭亮，克劳特，R.和沃兰，T.用成像荧光互相关光谱研究细胞膜组织的扩散、转运。J。97, 2630 - 2639(2009)。