风暴——随机光学显微镜重建

图1:比较传统和风暴的图像在哺乳动物细胞线粒体。线粒体外膜蛋白Tom20标记。(左面板)传统图像的左侧部分细胞。(中间面板)风暴3 d图像的中间部分的细胞。z维信息颜色根据比例尺的颜色。(右面板)。风暴的xy截面图像的权利的一部分细胞。图片由壮族研究小组,化学与化学生物学系,哈佛大学,剑桥,马。

分辨率限制由经典光衍射代表的一个主要限制的能力获得有意义的见解的活细胞。传统光学显微镜工具只有显示结构直径约200海里。不幸的是,大多数细胞细胞器参与生理过程包括细胞间通讯,细胞生长和分裂往往低于这个限制阈值。事实上,许多细胞骨架总成可以小于50 nm和我们理解其功能可以大大提高如果直接光学纳米领域是现成的。

一种新颖的三维超分辨率显微技术已经使人们有可能获得新的见解不肯舍弃以前的环境。的方法重建三维随机光学显微镜(“风暴”)所描述的壮族实验室最近使整个团队形象多色细胞。使用多个photoswitchable标签,整个线粒体网络固定哺乳动物细胞被审问,阐明线粒体形态和微管相互作用被掩盖在传统的荧光图像。

风暴方法使用连续成像的单分子荧光团明亮和黑暗状态之间切换。通过激动人心的只有一个随机子集的单一标签的激活脉冲激光器,获得一个低亮度图像的单个分子可以分辨单个衍射极限点。这使得每个荧光分子的位置与纳米精度决定。这样的脉冲重复周期允许所有分子的位置确定,随后建设超分辨率图像从这些精确的荧光团的位置决定的。

二维图像与20 - 30 nm横向分辨率最初。扩展到3 d定位一直是通过引入一个“散光”生成两个稍微不同的焦平面成像方法,允许轴向位置的分子决心50 - 60纳米的准确性通过分析荧光团的椭圆率和定位图像。

然而,纳米录音涉及成像有限数量的孤立分子每帧。此外,短曝光时间和快速帧速率是至关重要的时间范围内获得必要的合成图像集后,最终将使技术用于活细胞的动态过程。

最近的进步在超分辨率可能与电子和或用电荷耦合器件(EMCCD)技术。即使在弱光条件下图像采集是一项具有挑战性的任务由于低信号/高噪音的本质这样的实验的主要优势和或′年代高性能iXon超888 EMCCD相机是最小化的能力相机噪声地板,即使在快速读出速度。特殊特性,比如“光集中出现传感器模式”收购,与最佳读出电子学相结合,确保iXon超888也可以提供业界领先的帧速率。