自旋盘共聚焦显微技术综述

在传统的宽视场光学显微镜中，标本沐浴在激发荧光团的光中(图1一个)．由物镜焦平面外的标本发出的荧光干扰聚焦特征的分辨率。随着样品厚度的增加，在失焦信号上捕捉精细细节的能力变得越来越具有挑战性。共焦原理通过使用针孔来拒绝失焦光，并具有提高横向和轴向分辨率的额外好处。正是这些好处使共焦显微镜如此受欢迎，这也是为什么你在大多数核心成像设备中都能找到它。

从…中可以看出图2(图中)，只有来自右侧平面的光(用绿色表示)通过针孔。来自成像平面上方的平面(用红色表示)的光集中在针孔上方，因此大部分光无法通过针孔。相反，来自成像平面下方的平面(黄色表示)的光在针孔前聚焦，无法穿过针孔。因此，只有来自一个平面的光被聚焦，才能通过针孔或顾名思义“共聚焦”。类似的原理适用于针孔相机，它使用针孔来获得不需要镜头的清晰图像。

共焦显微镜

共聚焦显微镜现在是一种常规使用的光学技术，横跨广泛的生物科学，从植物科学到哺乳动物模型。它的使用很受欢迎，因为它比传统的宽视场显微镜有几个优点，即它能够去除失焦信号，从降低的焦点深度捕获信息，在厚样品中成像离散光学切片，从而创建高对比度的3D图像集。

最常见的共焦技术是共聚焦激光扫描显微术(样品形貌)．在这种格式中，样品被激光的单点光照射(图1 b)．激光束以光栅模式逐点扫描，信号由光电倍增管从每个点依次检测，直到生成整个图像。使用CLSM，在图像分辨率和速度之间需要权衡。如果阵列由512x512像素阵列组成，并且每个点被照亮1微秒，那么每次扫描将花费大约262毫秒。来自每个点的信号必须在1µs内获得，扫描中的第一个点和最后一个点之间有0.26秒的时间“倾斜”。为了补偿每个像素的短暂照明，需要强烈的激光束，如果样品是动态的，时间倾斜会导致观测误差。

图1所示。说明常规宽视场、激光扫描和旋转圆盘显微镜的照明模式的示意图。在宽视场显微镜中(a)，样品被激发光广泛照射，其能量的有限焦点通过物镜的数值孔径和焦深决定。激光扫描共聚焦显微镜(b)通过一个小孔径(针孔)聚焦单点激光，逐点扫描样品。自旋盘共聚焦显微镜(c)用1000个针孔的旋转模式照亮样品，以实现完全同时共聚焦照明。

自旋盘共聚焦激光显微术(SDCLM)通过利用多路复用原理．图1 c说明样品如何被照亮，因此光检测，在多个点同时。这最初是由Felgett在光谱学中证明的，并表明使用并行检测可以提高灵敏度。王发表的一篇文章提供了用于活细胞标本成像的点和盘扫描系统的定量比较。

图2。横河CSU-X的双磁盘安排。除了包含针孔阵列的基本磁盘之外，还有与微透镜匹配的模式的第二个收集器磁盘。微透镜将激发光以更高的效率聚焦到成像针孔上，从而将激发通量从有限的~2%提高到功能性的70%。这项技术的改进，结合使用电子倍增CCD探测器，导致旋转盘技术成为快速活细胞共聚焦成像的理想解决方案。

图2展示了双旋盘共聚焦激光扫描仪运营。与传统的激光扫描显微镜不同，在SDCLM中，一个扩展的光束照亮了布置在(收集器)磁盘上的微透镜阵列。每个微透镜都有一个相关的针孔，该针孔横向共对齐在第二个(针孔)磁盘上，并轴向定位于微透镜的焦平面上。这些磁盘被固定在一个由电动机高速驱动的公共轴上。当磁盘旋转时，扫描仪与位于其主成像平面的针孔磁盘的显微镜耦合，聚焦的激光束阵列扫描标本。横河意识到这种方法的好处，并创建了他们的CSU旋转盘共聚焦单元。Andor的蜻蜓多模态共聚焦技术通过提高通量、照明均匀性和针孔间距来处理从单分子到酵母到3D模型器官(类器官)的更广泛的标本，将这一技术提升到了一个新的水平。

针孔(和微透镜)以一种模式排列，它扫描由阵列孔径大小和显微镜物镜放大倍率定义的视场。扫描激光束激发样品中的荧光标签。荧光发射将是最强烈的阵列聚焦-焦平面。这种光的一部分将沿着激发路径返回，它将优先被相同的“共聚焦”针孔选择。一个反射发射波长的二向色镜位于两个圆盘之间。这将激光发射与显微镜光学反射或散射的任何激发光分离。发射路径的几何形状导致具有极低背景噪声的共聚焦荧光信号。

传统CSLM的另一个限制是使用光电倍增管其量子效率(QE，将光子转化为电子的概率)相当低——通常为30-40%。相比之下，SDCLM技术使用相机作为探测器，可以具有非常高的QE;例如,和或iXon+ 897 EMCCD峰值QE超过90%，使其成为近乎完美的探测器。这种双旋转圆盘和高QE探测器的组合提供了一个可以高速运行并具有无与伦比的信噪比(SNR)的共焦仪器。

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