牛津仪器集团的一部分狗万正网地址
扩大

利用可光切换蛋白对对细胞信号的时空控制

利用诸如GFP这样的光学报告器,人们已经了解了很多关于细胞及其蛋白质的知识,但科学家们还想知道更多。越来越多的研究人员不仅利用光来观察细胞功能,而且还以异常精确的方式控制它们。细胞功能的光学操纵正在前沿研究中被用于控制生物行为,表征信号通路和测试细胞网络模型。这种方法被称为“光遗传学”,并被命名为《自然》“年度最佳方法”在2010年。在那之后的几年里,光遗传学工具已经被更多的研究团队所使用,并在神经科学和其他领域得到了更广泛的应用。

来自加州大学旧金山分校的研究人员利用植物的光敏色素信号网络开发了一种基因编码的光控系统,用于对蛋白质进行精细的空间和时间控制。光刺激装置称为“马赛克是光学装置的关键部分,使他们能够在哺乳动物细胞中实现蛋白质募集的紧密空间模式。光敏色素是一种感光信号蛋白,通过检测红色和近红外光来控制植物的许多光敏过程。研究人员优化了光敏色素B (PhyB)和光敏色素相互作用因子3 (PIF3),以产生一个光敏对Phy-PIF,它响应红光(650 nm)结合,并响应红外光(>750 nm)解离。当PhyB与膜结合时,可以看到荧光标记的PIF3在650 nm光照下转移到质膜,在那里形成Phy-PIF复合物。

他们通过局部诱导荧光标记的Phy-PIF募集来测试可光开关蛋白对微点显微镜激光系统,这使得激光照明具有接近衍射限制的几何形状,并实时查看激光照射。研究人员在质膜的一个区域上集中了来自紫外线泵浦的罗丹明650 nm染料细胞激光的低强度的连续20 Hz 650 nm光脉冲,而整个细胞同时暴露在来自过滤亮场源的最大强度的抑制性IR光下。TIRF成像使他们能够判断吸收的荧光团是否在膜中而不是在细胞质中,因为它能成像薄细胞区域。

研究人员随后开发了一种全自动方法,将细胞暴露在两种波长的光下。研究小组成员Orion Weiner博士说:“开发光学装置的主要挑战是同时出现红光和红外光的反向模式。”“为了对抗等离子膜结合的PIF-YFP的横向扩散,我们需要一个被红外光反区包围的招募区(红光)。”为了实现这一目标,研究人员与光子仪器公司合作开发了一种“互补马赛克主动照明系统”,该系统将红光耦合到设备镜子的“开”状态,并将单独的红外光源耦合到镜子的“关”状态。在这种配置中,设备对用户定义区域中的“目标”活动和这些区域之外的“静默”活动都起作用。

马赛克,因为它成为众所周知的,包含一个阵列的数十万微观半导体为基础的镜子被称为数字微镜设备。铰链安装的镜子可以非常快速和有效地单独倾斜,允许同时生成红色像素和红外像素的反向模式。“没有其他的商业设备可以同时产生红光和红外光的反向模式,”韦纳说。“这对于我们利用Phy/PIF系统在哺乳动物细胞中产生紧密的蛋白质募集空间模式的能力至关重要。”

使用马赛克二重奏,他们甚至可以在细胞膜上投射一个简单的基于像素的电影。细胞膜的TIRF成像使用Andor iXon EMCCD相机显示,照明模式产生的特征小到3 μm。研究小组的负责人Anselm Levskaya说,iXon相机允许他们使用尽可能少的荧光激发光,这是可取的,因为成像波长也会轻微激活光激活系统。

研究人员还可以使用软件来“抖动”目标面具中的平均红光量,使他们能够平稳地滴定活性Phy和招募的PIF-YFP的比例。这表明该技术可以用于化学势的“灰度”控制。

研究人员开发的基因编码,光可切换Phy - PIF相互作用模块具有滴定和可逆相互作用,可能被用于控制依赖于招募事件的任何活细胞过程。由于光可以用高空间和时间分辨率进行控制,因此使用Phy-PIF模块可以驱动高度复杂的空间或时间模式。

该研究小组还使用了具有闭环控制的系统来自动调节光调制信号转导通路的激活。Levskaya说,这对于用单细胞进行定量显微镜实验很重要。他们预见Phy-PIF模块可用于控制各种各样的细胞生物过程,而无需逐个进行蛋白质工程。

列夫斯卡娅说:“我认为它最大的应用之一将是干扰发育中的动万博电脑网页版登录物的基因转录和信号转导途径。”“能够在时间和空间上改变信号和基因的产生,应该允许我们在开发过程中进行非常新颖的实验,试图逆向工程建立动物身体计划的机制。”

Mosaic和MicroPoint都是Andor产品系列的一部分光刺激.在这些工具开发后的几年里,他们帮助许多研究小组使用光遗传学技术来帮助研究神经科学的许多领域,并更广泛地应用于遗传控制和调控的其他领域。

时空的控制

图1:

一个光可逆募集系统由膜靶向光敏色素组成,由红光(650 nm)激活,近红外光(750 nm)失效。在膜结合的光敏色素池激活后,自由扩散的YFP标记的PIF结构域迅速被吸收到质膜上。失活时,这个池被释放回细胞质中。B-通过形成红光和红外光的空间模式,活性光敏色素在膜上的分布可以被精细控制,从而允许YFP-PIF在空间上定向招募到特定的亚细胞位置。

时空的控制

图2:

PIF-YFP被招募到NIH 3t3细胞的膜上,使用一盒红光和红外光的逆掩膜。右边的面板显示随着红灯的打开和关闭,膜的易位和释放。感谢加州大学旧金山分校的Anselm Levskaya, Orion D. Weiner, Wendell A. Lim和Christopher A. Voigt

相关阅读

日期:2021年12月

作者:马克·布朗博士和艾伦·穆兰博士

类别:应用注释

下载为pdf

分享

相关资产