在空间转录组学中使用Split FISH

实验室:新加坡基因组研究所陈氏实验室

当细胞在组织中发育和发挥功能时，许多变化不仅发生在RNA转录水平上，还发生在组织内细胞基因表达的更大的空间组织水平上。因此，在单细胞水平上研究这些RNA谱的变化可以提供关于组织状态的丰富信息。正常RNA谱的改变也发生在异常情况下，如肿瘤组织的发育。因此，对这些转录组信息的研究和表征可以广泛应用于肿瘤学、神经科学、行为研究、药物筛选和疾病治疗等领域。一直在推进空间解析转录组学研究的一个研究小组是陈实验室在新加坡基因组研究所。

用于RNA谱分析的技术

研究细胞和组织内的RNA谱(即RNA的空间组织和相对丰度)有许多策略和变体。其中包括:多路单分子荧光原位杂交(smFISH)，单细胞原位测序和空间RNA测序。这些技术有不同的优点和缺点，但它们都旨在提供完整组织中尽可能完整的细胞转录组概况。在多重FISH的情况下，这是通过使用寡核苷酸探针在它们的原始位置检测不同的RNA物种来实现的。这些技术使得发现微妙而重要的关系成为可能，否则可能不明显。了解更多有关使用用于多重原位杂交的共聚焦显微镜．

将多路FISH应用于复杂组织的RNA谱分析

将多重FISH应用于复杂组织样本的RNA谱分析的主要挑战之一是很难检测单个RNA分子。复杂的组织通过自身荧光形成背景，而吸收和散射进一步减弱了来自标记探针的已经很低的信号。另一个问题来自于寡核苷酸探针的非特异性结合，这不仅提高了噪声下限，而且导致假阳性信号。许多研究试图在组织背景下放大信号。然而，仍然存在的问题是，非特异性结合探针也被放大了，然后假阳性仍然存在。这是使用多路FISH进行RNA分析的一个特殊问题，因为涉及的探针数量和多样性很大，这使得很难优化所有探针的长度和熔化温度。

组织清除提供了一种清除非特异性探针结合的细胞蛋白质和脂质的方法。组织清除的一个局限性是它不能解决探针与非靶rna的非特异性结合。解决这个问题的另一种方法是使用“分裂RNA探针”。当分裂探针对的两半都成功地近距离结合时，分裂探针才会产生荧光信号。这将显著减少非特异性结合探针产生的假阳性数量，并解决成功将多路FISH应用于组织的挑战。

split - fish -应用分裂探针方法进行RNA分析

最近，Goh等人，2020年在他们的论文《组织中具有分裂- fish的高特异性复用RNA成像》中提出了这种称为“Split-FISH”的技术。Chen实验室的团队报告称，Split-FISH允许在广泛的组织中进行RNA分析。

利用分裂探针的概念，他们实现了317个基因的高度特异性标记，减少了未清除组织中的脱靶背景荧光和假阳性。他们继续通过揭示小鼠大脑、肾脏、肝脏和卵巢组织中单个细胞的各种转录组的空间分布来证明这项技术的有效性。

• 原始研究论文:组织中具有分裂fish的高特异性多路RNA成像。
• 查看网络研讨会在这项研究中。

所选基因的解码转录本位置被覆盖在用Sona 4.2B-11拍摄的拼接图像上。比例尺，100 μm。在本例中，可以在小鼠脑组织中观察到具有(Itpr1)和不具有(Map4)细胞体的区域转录本的不同定位。(Goh等人，2020年)

图像的设置

用于RNA谱分析研究的探测器应具有高灵敏度和低噪声，以便能够检测荧光标记的RNA探针，特别是在处理复杂组织时，这些探针可能相对暗淡。要研究更大范围的组织或细胞场，大视野也是非常有益的。由于大的图像数据集通常需要高吞吐量，因此有一个高速运行的成像相机是很重要的。

对于多路FISH和共定位实验，陈实验室使用了基于尼康Ti2-E机身的定制显微镜(尼康CFI Plan Apo Lambda ×60 1.4 NA油浸物镜)。一个Sona 4.2B-11背光sCMOS摄像机这提供了高灵敏度、速度和最广阔的视野的必要组合。

对于其他成像实验，一个定制的显微镜是基于尼康Ti-E机身(尼康CFI Plan Apo Lambda ×100 1.45 NA油浸物镜)。一个iXon Ultra 888 EMCCD相机它提供了更高的灵敏度，但速度较慢，视野较小。

关于新加坡基因组研究所陈实验室

陈实验室的研究人员对“原位组学”如何应用于回答细胞生物学和疾病过程中一些最复杂的问题很感兴趣。“原位组学”数据可用于识别和分析分子定义的细胞类型、基因网络和空间环境中的细胞信号事件。这使得它成为一种非常有效的方法来了解组织生物学和潜在的复杂而微妙的变化，这些变化是由疾病引起的细胞内发生的。为了进行他们的研究，陈实验室使用了一些最新的显微镜工具，如蜻蜓多模态共聚焦系统微流体系统和下一代测序系统。此外，他们工作的一个关键部分是开发计算软件工具，以帮助在单细胞和组织水平上分析基因组和转录组信息。

了解更多关于陈实验室的研究:陈实验室@ GIS (khchenlab.github.io)

近期刊物精选

1. 高建军龙*，周宁*，肖文英，哈宁，郑春萍，张颖，赵志伟，陈坤华，组织中高特异性多路RNA的分裂- fish成像。《自然方法》(2020)https://doi.org/10.1038/s41592-020-0858-0．
2. 王国光*，郝建华*，王国光*，陈坤华，庄鑫。基于多路误差稳健荧光原位杂交的高通量单细胞基因表达谱分析。中国科学(d辑:自然科学版)，36(4)，444 - 444(2016)。
3. 陈坤华*，陈建仁*，陈建荣*，王胜*，庄兴。单细胞空间分辨高复用RNA谱分析。科学348,aaa6090(2015)。