利用量子点成像实时可视化呼肠孤病毒进入宿主细胞

量子点，也被称为Qdots或QDs，是尺寸在2到10纳米之间的半导体晶体。它们可以发出比传统荧光蛋白(如GFP)更亮的荧光，稳定且具有离散的发射光谱。这些光学特性使得量子点在典型光子水平非常低的单分子跟踪研究中非常有用。在许多病毒学研究中也出现了类似的光状态，特别是在活细胞跟踪中。对于活细胞来说，来自标记病毒蛋白的信号非常低，这使得它特别具有挑战性。现在已经建立了用Qdots高效标记病毒的技术。

呼肠病毒和细胞侵入

呼肠孤病毒是一组非包膜双链RNA病毒，在环境中无处不在。它们的宿主范围很广，包括动物、植物和微生物。在人类中，呼肠孤病毒通常与影响胃肠道系统的轻微疾病有关。这一组中的一些病毒，如水生病毒，是商业上重要鱼类(如鲑鱼)的病原体。

病毒进入宿主细胞是任何成功感染的第一步，因此是开发抗病毒药物和治疗方法的主要靶点。病毒使用许多策略来克服膜障碍，如膜融合或内吞作用。像呼肠病毒这样的非包膜病毒不能使用膜融合，因此通常采用内吞作用。研究病毒进入在技术上具有挑战性，这一过程对呼肠孤病毒是未知的。

利用量子点(Qdots)破译细胞入口

刘杰博士、张启亚教授及其同事在《微生物学前沿》(Frontiers In Microbiology)最近发表的《实时解剖呼肠孤病毒颗粒的进入和细胞内动态》(real - time the Entry and Intracellular Dynamics of Single Reovirus Particle)中表明，他们可以应用基于q点的单颗粒跟踪显微镜实时揭示呼肠孤病毒的感染过程。他们研究的病毒是一种海洋呼肠病毒:大菱鲆呼肠病毒(SMReV)。Qdot成像得到生化分析和电子显微镜的支持和验证。

图片转载自刘等．病毒和细胞骨架成分的可视化和跟踪。细胞骨架依赖的运动SMReV活的GCF细胞中的粒子。(A)的时间进程SMReV与肌动蛋白丝共定位。量子点,SMReV粒子(红色)与(黄色)共定位pRFP-LifeAct(绿色)标签肌动蛋白丰富的突出在0分钟皮。(0分钟)，15分钟时在细胞外围区域出现长肌动蛋白丝皮。(15分钟)，并与点样肌动蛋白在30分钟皮。(30分钟)，分别。(B)快照SMReV粒子和微管。量子点,SMReV(Int，红色)与pEGFP-MAP4共定位标签微管(绿色)显示黄色信号(箭头标记)。不同时间(0 ~ 18.4 s)放大图像显示SMReV沿着微管向细胞内部移动。酒吧:5μm．

结果表明，单膜结合呼肠孤病毒颗粒可在数秒内通过新生网格蛋白包被的凹坑进入细胞。大多数病毒粒子在感染后30分钟内被内化在细胞质内。使用特定抑制剂，刘等．表明SMReV的进入依赖于网格蛋白介导的内吞作用，而不是cavolin介导的内吞作用。在进入细胞后，可以继续跟踪标记有Qdots的内化单个病毒粒子的运动。分析表明，肌动蛋白密集区域内靠近内膜的最初缓慢和定向运动，向细胞内部快速运动。这表明SMReV转运是通过细胞骨架介导的。此外，使用病毒和细胞骨架双重标记的共定位和抑制剂分析都表明，SMReV的转运依赖于细胞外围的肌动蛋白丝，然后依赖于向细胞内部的微管。有趣的是，病毒颗粒也通过核内体-溶酶体系统被运输、分类和包装，通过早期核内体到晚期核内体，然后被运送到溶酶体。

Qdot成像设置

Qdot标记病毒粒子的荧光图像通过基于Andor旋转盘的共聚焦显微镜使用100倍物镜和在线培养系统(INUBG2-PI)获得。为了检测产生的信号，一个Andor iXon EMCCD相机用作成像相机。这种共聚焦成像装置允许活细胞成像和跟踪实验。EMCCD相机提供所需的灵敏度。

本研究表明，Qdots可以有效地用于活病毒从最初进入宿主细胞到与作用相关的跟踪，并通过细胞的微管网络进行跟踪。

研究论文：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2018.02797/full

选定的出版物

• 洪志勇，刘淑林，庞德伟(2020)一种用共聚焦荧光显微镜统计评估单闪烁量子点荧光强度的方法†
• 刘世林，王志国，张志林，庞德伟(2016)。利用量子点追踪单个病毒感染宿主细胞。化学。Soc。启示录45,1211 - 1224。doi: 10.1039 / C5CS00657K
• 刘,S . L。田,z Q,, z L。,,问:M。,赵,h·S。任,b(2012)。用于单病毒成像的流感病毒高效双标记。生物材料33,7828-7833。doi: 10.1016 / j.biomaterials.2012.07.026
• 刘海波，刘勇，刘松，庞德伟，肖国锋(2011)。通过传染性造血坏死病毒量子点标记可见网格蛋白介导的活宿主细胞内吞作用。中华病毒学杂志85,6252-6262。doi: 10.1128 / JVI.00109-11