拉曼光谱的基本原理是什么

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非弹性散射辐射的波长偏移提供了化学和结构信息。拉曼位移光子可以具有更高或更低的能量，这取决于所研究分子的振动状态。下面是说明这些概念的简化能量图。

斯托克斯辐射发生在较低的能量(较长的波长)比瑞利辐射，和anti-Stokes辐射有更大的能量。能量的增加或减少与分子基态的振动能级有关，因此，观察到的斯托克斯和反斯托克斯特征的拉曼位移是分子振动能量的直接测量。拉曼光谱示意图如下所示。

斯托克斯线的散射辐射能量小于入射辐射，而反斯托克斯线的散射辐射能量大于入射辐射。激发态的能量增加或减少与分子基态的振动能间距有关，因此斯托克斯线和反斯托克斯线的波数是分子振动能的直接度量。

在示例谱中，注意斯托克斯线和反斯托克斯线与瑞利线的位移相等。这是因为在任何一种情况下，一个振动量子的能量会得到或失去。同时，请注意，反斯托克斯线比斯托克斯线要弱得多。这是因为只有在辐照之前被振动激发的分子才能产生反斯托克斯线。因此,在拉曼光谱通常只测量较强的斯托克斯线-拉曼散射是一个相对较弱的过程。拉曼散射的光子数量非常小。然而，有几种方法可以用来提高拉曼测量的灵敏度。

简化能量图

如果激发激光的波长与分子的电子吸收相一致，与吸收发色团相关的拉曼振动强度将增强102到104倍。这种共振增强或共振拉曼效应非常有用，不仅在显著降低检测限方面，而且在引入电子选择性方面。因此，共振拉曼技术被用于提供对感兴趣的物种的结构和电子洞察。

金属卟啉、类胡萝卜素和其他几类生物学上重要的分子强烈允许可见的电子跃迁，使它们成为共振拉曼光谱的理想候选者。共振选择性有进一步的实际用途，即色谱部分的光谱共振增强，而周围环境的光谱则没有。对于生物发色团来说，这意味着吸收活性中心可以被可见的激发波长特异性探测，而不是周围的蛋白质基质(这将需要紫外线激光引起共振)。

共振拉曼光谱学也是金属中心配合物，富勒烯，聚二乙炔和其他强烈吸收可见光的“外来”分子化学的重要探针。尽管有更多的分子吸收在紫外线中，这一光谱区域的激光和光学的高成本限制了紫外线(UV)共振拉曼光谱的少数专家团体。

拉曼光谱示意图

共振增强的振动可分为两三个一般的机械类。最常见的情况是Franck-Condon增强，其中振动的法坐标的一个分量发生在分子在电子激发时膨胀的方向上。分子在吸收光时沿这条轴膨胀得越多，增强因子就越大。卟啉的环状呼吸(平面内扩张)模式就属于这一类。耦合两个电子激发态的振动也通过一种叫做振动增强的机制得到共振增强。在这两种情况下，增强因子大致跟随吸收光谱的强度。更完整的共振增强理论超出了本节的范围。

共振增强不是从一个明确定义的波长开始的。事实上，如果激发激光在分子电子跃迁以下100个波数以内，则可以观察到5倍到10倍的增强。这种“预共振”增强在实验上是有用的。

从化合物(或离子)吸附在结构金属表面上，甚至在几埃范围内，拉曼散射可以比溶液大103到106倍。这种表面增强的拉曼散射在银上最强，但在金和铜上也可见到。在实际激发波长下，对其他金属的增强作用不重要。

SERS源于两个机制:

1. 第一个是增强电磁场在金属表面产生的。当入射光的波长接近金属的等离子体波长时，金属表面的传导电子被激发成一种称为表面等离子体共振的扩展表面电子激发态。分子吸附或接近表面经历一个特别大的电磁场。垂直于表面的振动模增强最为强烈。
2. 增强的第二种方式是通过电荷转移复合物的形成在表面和分析物分子之间。许多电荷转移配合物的电子跃迁是可见的，从而发生共振增强。具有孤对电子或π云的分子表现出最强的SERS。这种效应最初是用吡啶发现的。

其他芳香族含氮或含氧化合物，如芳香族胺或苯酚，具有强烈的SERS活性。这种效应也可以在其他富电子官能团如羧酸中看到。表面等离子体共振的强度取决于许多因素，包括入射光的波长和金属表面的形态。波长应与金属的等离子体波长相匹配。对于一个5μm的银颗粒，这大约是382 nm，但对于更大的椭球银颗粒，这可能高达600nm。铜和金的等离子体波长为650nm，其他两种金属的SERS波长为350-1000 nm。表面等离子体共振激发的最佳形态是小颗粒(<100nm)或原子粗糙表面。SERS通常用于研究吸附在金属上的单层材料，包括电极。

其他流行的表面包括胶体、介电基材上的金属薄膜，以及最近通过短键结合到金属或介电胶体上的金属颗粒阵列。虽然SERS可以很容易地观察微摩尔(10x-6)范围内溶液浓度的拉曼光谱，但定量测量的不可再现性在过去损害了其用于分析目的的实用性。然而，SERS活性介质生产的标准化也在稳步提高其在这一领域的潜力。

UVRRS是复杂生物系统分子分析的有力工具。大多数生物系统吸收紫外线辐射，因此有能力提供与紫外拉曼激发共振。这导致了高选择性共振拉曼效应，能够增强重要的生物靶标，如蛋白质或DNA。例如，200nm左右的激发增强了酰胺基振动的拉曼峰;220nm左右的激发增强了某些芳香族残基的峰。来自水的拉曼散射很弱，可以分析非常弱的水体系。

光纤UVRRS配置

由于UVRRS的选择性，通常需要一个可调谐激光器作为激励源。由于真正可调谐的连续波激光器还不存在，具有倍频输出的Nd: yag泵浦染料激光器是一种合适的UVRRS系统。根据所使用的染料，这种激光装置几乎可以提供任何所需的UV波长。加剧了ccd带有UV光电阴极(iccd)，背光ccd或带有UV增强(BASF lumogen)涂层的ccd可用于UVRRS探测器。使用这些探测器的原因是检测效率高而且多通道功能．UVRRS和光纤光谱学融合的主要障碍是日晒，紫外线辐射会导致光纤(甚至是非常纯的二氧化硅纤维)不透明。这种不透明性损害了传输，使得标准光纤对UVRRS毫无用处。

感兴趣的物种

脉冲激光通常用于短命物种的研究。一个激光脉冲可以提供给一个分子系统，有足够的能量来重新分配分子中的电子，导致激发态的形成，如右图所示。这种激发态分子的拉曼光谱可以使用同一激光脉冲或来自第二个激光的不同脉冲(单色和双色脉冲拉曼)进行研究。感兴趣的激发态可以有生命期，从皮秒到毫秒，但大多数可以使用5ns量级的门控来研究。由于大多数激发态是使用紫外和可见光激光器产生的，具有高紫外和可见光量子效率(QEs)的光电阴极通常是合适的。

泵浦探头(双色)拉曼原理图

最简单的脉冲激光实验是所谓的单色实验，其中高辐照度激光脉冲被用来启动光反应，然后拉曼探测在脉冲宽度内产生的瞬态物种。如图所示，打开增强管，只记录激发态的拉曼光谱。这种脉冲/ICCD门组合将被重复和累积数百到数千次，以实现具有高动态范围的良好整体信噪比。

在时间分辨共振拉曼(TR3)光谱中，不同波长的激光脉冲对被用于光解(光学“泵浦”)，然后拉曼探测感兴趣的瞬态物种。选择光谱仪/探测器的光谱窗口，使其对应于来自探针激光器的拉曼散射的频率范围。

脉冲双色拉曼布局在延迟发生器的控制下的延迟

在时间分辨共振拉曼光谱(TR3)，不同波长的激光脉冲对被用于光解(光学“泵浦”)，然后拉曼探测感兴趣的瞬态物种。选择光谱仪/探测器的光谱窗口，使其对应于来自探针激光器的拉曼散射的频率范围。

通过记录光解事件后不同延迟的一系列光谱，即激发和探针脉冲之间的一系列时间延迟，监测瞬态信号的时间演化。的ICCD相机或者任意一个激光都能触发。延时发生器用于控制延时。

在拉曼显微镜中，一个研究级光学显微镜与激发激光和光谱仪耦合，从而产生一个能够获得常规图像的平台，此外还可以从接近衍射极限(~1微米)的样品区域生成拉曼光谱。成像和光谱学可以结合起来生成“拉曼立方体”，即三维数据集，在二维图像的每个像素处产生光谱信息。

机动的xyz显微镜台可用于自动记录光谱文件，这些文件将构成从预选点记录的拉曼图像、拉曼图或一组拉曼光谱的基础。特定的软件程序将允许快速和容易地重建这些地图。与传统光谱学或显微镜相比，利用各种特殊特征生成样品的二维和三维图像的可能性是明显的优势。

延时序列

第一台拉曼“仪器”于1928年制造出来。该仪器使用单色阳光作为光源，人眼作为探测器。拉曼仪器被开发出来(基于弧光灯和照相板)，并很快变得非常流行，直到20世纪50年代。从这些早期开始，拉曼仪器有了显著的发展。现代仪器通常包括一个激光器，瑞利滤波器，几个透镜，一个光谱仪和一个探测器(通常是CCD或ICCD)。

典型的连续波(CW)拉曼布局

色散拉曼的主要优点之一是它提供了选择最佳激光激发波长以记录最佳拉曼信息的可能性。例如，可以选择波长以提供与所研究的样品的最佳共振。

还可能需要调整波长以避免荧光和热发射背景。目前，可以使用从紫外(低至200nm)到红外(1.06μm Nd:YAG激光线)，从微瓦到几瓦的激光线。

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