探索显微技术:共聚焦，宽视场，透射光和反褶积

显微镜是现代生命科学应用的重要工具。万博电脑网页版登录从医学诊断(例如，确定感染的来源或肿瘤的严重程度)到食物分析。有了这样的需求，在过去的十年里，显微镜技术出现了蓬勃发展，使研究人员能够看到光的衍射极限之外，并对复杂的过程有了更多的了解。然而，易用性和高端技术的可获得性都很难在市场上的单一产品中找到。

随着显微系统的发展，显微技术也在同步发展。第一个显微镜技术是基于透射光学显微镜．对现代显微镜学家非常有价值的其他技术是宽视野荧光显微术而且共焦显微镜．此外，通过光子重分配进行图像重建和处理是成像采集后处理的关键因素。因此,反褶积软件已经成为采集后图像处理的必备工具。

图1 -用Andor Dragonfly成像的梨状支架共焦体积。253片光学切片，在Dragonfly上用40倍(1.1 NA)水物镜和40微米针孔捕获。德累斯顿工业大学维多利亚·严提供。特别感谢博士。华莱士·马歇尔和文森特·布德罗以及伍兹霍尔MBL的生理学课程。

在这篇文章中，我们将重点介绍显微镜采集和采集后技术，并对Andor显微镜系统解决方案进行总结。点击下面的按钮，直接导航到每个显微镜主题，并了解更多。

1.显微技术概述

1.1透射光学显微镜

在透射光学显微镜中，光通过样品，因此产生了术语“透射光学显微镜”。

最简单的方法是brightfield．该技术用于成像较厚的组织或组织染色，如苏木精和伊红染色，以提供图像的对比度和细节。然而，对于较薄和未染色的样品成像，brightfield并不理想。问题在于，细胞内部的结构无法产生足够的对比度，我们的眼睛无法看到。由于这个原因，透射光学显微镜技术的其他技术已经发展起来。

相差显微镜检查在光路中使用相位板环，在样品内的结构之间产生更高的相位差，转化为更高对比度的图像。相位对比是透射光学显微镜的一个很大的改进，可以观察到薄的未染色样品的结构。然而，这种技术的问题是产生的明亮晕(“相位晕”)可以隐藏细节。

另一种透射光学显微镜技术，提供高对比度和高分辨率是迪拜国际资本．DIC代表差分干涉对比；它的光学系统复杂而昂贵。DIC依赖于使用两个偏振器:一个放置在光照射样品之前，另一个放置在样品发出的光之后。偏振光的光线会结合在一起，产生轻微的位移;这种转变将产生高对比度和高分辨率的DIC图像。(了解详情-安多显微镜学派-透射光学显微镜）.

图2 -使用BC43的DPC成像方式对斑马鱼发育进行无染色成像。BC43活斑马鱼胚胎图像的单场图像，使用10倍成像物镜(1.84 mm的视场)。活胚从胚囊期(A)到受精后17小时的图像(F)。胚囊期50% (B)和75% (C)的胚胎，胚体期3- (D) (E)。斑马鱼的胚胎成像10倍的目标。图像为35层的最大强度投影，覆盖全范围700µm，和捕获每20分钟一次，持续14小时。28℃孵育。图片由Marco Campinho，阿尔加维大学和Claudia提供佛罗林多，安多科技公司

透射光学显微镜的最新发展是DPC -差分相位对比(图1)。Andor进一步开发了DPC，并将其应用于新型台式共聚焦显微镜BC43(专利正在申请中)。

DPC的工作原理是，可以从一对相反的照明角度拍摄的强度图像中提取相位梯度。利用DPC图像的数学算法，可以实现差分相位对比度图像的定量相位重建方法。(Tian L. & Waller L.， 2015)。

DPC不需要:

• 特定目标(如相位对比目标)，
• 偏振光学(如DIC)，以及，
• 可用于双折射标本成像(Tian L. et al.， 2014)。

此外，DPC允许在所有区域，所有时间(不依赖于调整角度或调整偏光器)。与DIC不同的是，DPC图像可以通过塑料盘子获得，这对于许多生物成像应用来说是实用的，而且通常是必不可少的。万博电脑网页版登录DPC即使在未染色的薄样品中也能提供高对比度和高分辨率成像(电影1)。

总之，DPC是一种易于使用的廉价的透射光学显微镜技术，可实现大照明角度，避免了机械扫描的困难。对于透射光学显微镜，DPC结合了最佳的相位对比和DIC成像技术。因此，DPC是一种优秀的“无标签”成像方法，在活体样品成像中具有明显的应用价值。万博电脑网页版登录

电影1 -哺乳动物细胞在TC培养皿上分裂的延时成像。24表达RFP-Cherry微管蛋白的哺乳动物细胞板，DPC和荧光成像超过14h。视频开始详细显示一个位置，结束于所有24孔，细胞维持在37ºC的二氧化碳独立介质。注意，DPC通过组织培养斑块的塑料提供最佳分辨率。

和或的蜻蜓而且BC43显微镜系统都有可用的透射光技术。新的台式共焦成像仪BC43，也适合无缝集成DPC到系统中。请参阅我们的BC43技术文章全面掌握该系统及其透射光学显微镜技术

1.2宽视野荧光显微镜

宽视场成像的特点是对样品进行充分的照明，随后检测样品发出的所有光。实际上，在宽视场成像中，探测器将捕获聚焦内的光而且失焦光。

宽视野荧光显微术是一种光学显微镜技术，如上所述(在透射光学显微镜技术中)，捕获来自样品的所有光(在焦点内和焦点外)。然而，宽视场荧光显微镜的基础是荧光的物理现象:

以下步骤可以描述荧光现象:

• 分子(或分子系统)吸收特定波长的光，即激发波长。
• 被激发的电子将在原子轨道中“跳跃”到更高的能级。
• 被激发的电子会回到基态并发射光子。
• 发射出来的光子将比激发的光子具有更长的波长(能量更少)。即发射波长

荧光是一种瞬时现象，一旦激发光被关闭，它就停止存在。宽场荧光照明可以实现使用汞和氙气灯泡领导光源，最近，基于激光的宽场照明。

图3 -使用Andor BC43宽视场成像法获得的哺乳动物细胞图像。图示前期细胞的宽视场图像。图像在采集后进一步反卷积，是一个最大强度投影35个堆栈在7µ米的范围内。深蓝色肌动蛋白，洋红色线粒体，黄色微管，青色dna。图片由Claudia Florindo - Andor Technology提供。

汞弧灯是第一个光源用于宽视场荧光显微镜。汞球的一个优点是激发波长有几个峰，与显微镜中使用的许多常见荧光团(313、334、365、405、436、546和579 nm)的激发波长重合。然而，光照在整个光谱上是不均匀的，这使得定量分析样品变得困难。此外，红外和近红外荧光色素不会被这种光源激发。最后，如果可能的话，最好避免汞这种有害物质。

的氙弧灯与汞弧灯相比，具有更均匀的可见光谱照明。然而，缺点是照明强度较低，以及在近UV/ UV范围内照明功率较低。这使得使用常见的DNA染色染料，如DAPI和Hoechst，使用这种光源具有挑战性，因为它们的发射很弱。此外，这些照明源(汞灯和氙弧灯)的寿命有限，如果经常开关照明，寿命就会缩短。

LED光源已经在荧光显微成像中确立了自己的地位。led已经发展成为一种高效的照明光源，具有长寿命，其持续时间不受开关系统的影响。近年来，LED光源变得流行起来，取代了曾经常见的汞和氙光源。

最近，安多已将其纳入共焦系统中,激光宽视场成像．基于激光的宽视场成像提供了锐利和精确的照明激发，从而允许激发样品荧光团。激光广角成像既可以提供高灵敏度样品成像所需的受控极低照明强度，也可以提供dSTORM超分辨率显微镜等高端技术应用所需的高得多的激光功率。万博电脑网页版登录

电影2 -宽视场成像模式允许在样品上捕捉多个通道数小时，没有光毒性或光漂白迹象。每8分钟获取100个时间点。对于每个时间点，我们获取3个通道和15个Z平面。实验持续10h以上。在实验结束时，没有光毒性和光漂白的迹象。(洋红色-组蛋白2bmcherry，青色-微管蛋白- gfp，黄色- Sir肌动蛋白)。图片来源:Ines Baião-Santos和Álvaro Tavares和Claudia Florindo - Andor Technology。

宽视场显微镜也有带通滤波器，选择性地允许所需的发射波长通过探测器。在宽视场显微镜中，检测器通常是照相机EMCCDs或sCMOS．去显微相机-比较相机技术和匹配他们的应用万博电脑网页版登录概述什么时候使用宽视场显微镜系统可用的不同成像探测器。

总之，宽视场系统捕获从样品发出的所有光，不提供光学切片。因此，它们不适合成像厚的和高散射的样品。然而，由于它们捕获了样品发出的所有光，宽场系统在以下方面很有用:

• 高感光性样品
• 快的事件
• 薄的样品
• Live-cell成像

适用于宽视场成像的样品是薄的低散射样品，如细菌、酵母、微藻和单层细胞。参见电影2和图3的广角成像示例。

Andor共焦系统解决方案蜻蜓而且BC43提供基于激光的宽视野成像。

和或蜻蜓提供所有的技术选项在广角成像。从最基本的常规应用，到同时双色成像，甚至是需要高激光功率万博电脑网页版登录的高端技术选项，如dSTORM超分辨率。

和或BC43是常规研究和应用需要较少专门的显微镜技术的主力。万博电脑网页版登录要求更低并不意味着谦虚。与BC43用户可以获得多达4种不同的荧光成像通道，这意味着可以用BC43荧光标记和检测4种不同的结构。

1.3共聚焦显微镜

宽视野荧光显微镜有其局限性和在宽视场显微镜下观察厚度大于30 μ m的样品是非常困难的，如果样品的厚度大于50 μ m，则几乎不可能．宽视场荧光显微镜的问题是产生的失焦光被探测器捕获，细节丢失。在这些情况下，解决方案是使用某种形式的光学切片来限制照明只在焦点区域。光学切片可以用共聚焦显微镜来实现。

共聚焦显微镜通过使用一个或多个聚焦光束扫描样品来照亮样品，并仅捕获来自被成像的光学部分的聚焦光。共聚焦显微镜有两种不同类型，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和旋转圆盘共聚焦显微镜．这两种共聚焦成像系统都可以通过样品进行光学切片，但这两种仪器背后的技术是根本不同的。

图4。说明点扫描仪和旋转圆盘显微镜照明模式的示意图。点扫描共聚焦显微术(一)聚焦单点激光通过一个小孔径(针孔)，并逐点扫描整个样本。自旋盘共聚焦显微术(b)用1000个针孔的旋转模式照亮样品，以实现完全的同时共聚焦照明。

激光扫描共聚焦显微镜(也叫点扫描共聚焦显微镜)用一小点高强度激光扫描样品。光斑使用物镜聚焦，并沿扫描区域横向移动以扫描样品。从发射的光中，只有聚焦中的Z部分将通过单个针孔，以创建光学部分(在该单点上)。发射出来的光通过针孔后，由传感器检测到光倍增管(PMT)．所得到的图像是扫描区域内所有扫描单点的和。

图5 - BC43共焦成像比目鱼图像由安多台式共焦- BC 43使用多个瓷砖获取和蒙太奇。获取了6个瓦片来组成覆盖554 μ m范围的图像。图片由Imaris提供(图片来源:Marco Campinho, universversidade do Algarve和Claudia Florindo, Andor tec檀香山)

激光扫描共聚焦显微镜的局限性包括动态范围获得的图像和获取速度(因为样本是逐点扫描的)。pmt的量子效率为45%，这意味着在100个被激发的光子中，只有45个会被转换成电子并被检测为信号，其余的将会丢失。由于激光扫描共聚焦系统采集速度慢，探测器量子效率低，不适合实时成像应用。万博电脑网页版登录

重要的是，由于点扫描仪的采集速度较慢，在对大样本进行成像时，需要折中分辨率，这将提供低于奈奎斯特标准的分辨率。此外，即使妥协分辨率，与优化的多点旋转磁盘系统，如Andor共焦系统．

(电影3)展示了一个提高生产力的例子。一个1.2毫米的鸡胚胎被成像，获得3个通道，220个成像平面和35个瓦片。完整的鸡胚头在2小时内获得了23 100张图像。在点扫描仪共聚焦系统中进行了相同采集设置的对比实验，该图像采集时间为15h。

电影3 -优化的多点共聚焦系统提供光学切片到毫米内蜱组织。1.2毫米深度清除的鸡胚用Andor Dragonfly在2小时内成像．这段视频展示了从一个1.2毫米的鸡胚胎HH28期头部获得的所有图像。用Andor Dragonfly获得完整的图像23 100张需要2小时，用点扫描仪成像相同的样本需要15小时。图像由Andor Dragonfly使用10X物镜和25微米针孔捕获。这段视频是由23100张显微镜图像合成的。图像由3个独立的荧光共聚焦通道获取，35个瓦，每个瓦有220个Z平面。

旋转盘共聚焦显微镜，也被称为多点共聚焦显微镜，使用包含多个针孔的磁盘扫描样本。针孔磁盘以高速旋转，并且传送图像所需要的小于完整的磁盘旋转。这导致了一个系统，可以提供光学切片共焦图像的速度为每秒44帧(AndorBC43)和每秒400帧(和或蜻蜓)(4)的电影。

Andor的旋转磁盘系统有一个内置的双微透镜系统，其中激光平行光线通过微透镜阵列聚焦，微透镜与旋转磁盘上的针孔同步。这种双系统确保了更好的光捕获效率，减少了图像中的背景噪声。因此，它降低了实现优秀共焦图像所需的激光功率。

电影4 -小鼠肠道血液流动的体内成像。使用Andor sCMOS相机以每秒200帧的速度获得的图像。样本由Takahiro Kuchimaru博士提供。(日本济市医科大学)。

进一步旋转圆盘共聚焦显微镜使用基于相机的探测器。相机基础探测器提供的量子效率是2 x大于光倍增管(pmt)的量子效率．在实际应用中，为了从激光扫描显微镜中的图像中获得相同的信号和噪声，与使用基于摄像头的探测器的等效系统相比，样品需要用2倍多的激光功率照射。注意，在样品照明中增加激光功率将导致更多的样品漂白和光毒性。

尽管第一代自旋盘共聚焦显微镜提供光学切片，但它不允许在细胞和组织深处成像，因为图像在30微米深左右会受到针孔声扰的影响。然而,和或蜻蜓和和或BC43有优化针孔间距和尺寸，使系统能够在细胞和组织深处进行光学切片从几百纳米到毫米的深度。

总的来说，共焦系统有两种类型:

• 激光扫描共聚焦显微镜(或点扫描仪)，和
• 旋转盘共聚焦显微镜(或多点共聚焦)。

激光扫描和旋转磁盘共聚焦提供光学切片，增加图像的信号噪声，并允许成像更深入的细胞和组织与宽视场系统相比。

尽管如此,旋转磁盘系统提供了更高的速度和生产力，增强的信号噪声，和温和的成像比点扫描仪共聚焦系统．由于这些原因，目前旋转圆盘技术正成为许多研究人员的首选技术。

2.反褶积:增强获取图像的分辨率

当光穿过任何光学系统(例如显微镜)中的光学元件时，就会发生畸变。任何无穷小的点都不会作为一个点出现，它会从焦点平面的上方和外部发出光，这将导致图像模糊。这个过程被称为卷积，是任何光学系统所固有的。

在卷积图像中，物体的每个点都是扭曲的。畸变可以用一个数学函数来计算点扩散函数(PSF)．(图6)最终得到的图像是将PSF应用于待成像物体上的所有点的结果。

图6 - PSF的3D图像图像显示了光学系统中单点成像的畸变，即点扩散函数(PSF)。

虽然卷积是任何光学系统所固有的，但与宽视场系统相比，共焦系统产生的图像要少得多。然而，无论使用什么系统来获取图像，结果图像总是会有卷积;这意味着由于光学的原因，产生的图像总是会有失真。系统捕获的离焦光越多，得到的图像就越曲折。因此，样本中失焦的光越多，得到的图像就越模糊。

就像卷积的数学线性的,值得庆幸的是，如果对卷积进行反向操作，物体的图像就可以恢复——这个过程被称为反卷积。简单来说，

反褶积算法将光子恢复到“它们所属的地方”，

提供物体的真实图像，不受光学系统引起的畸变。

反褶积算法迭代工作，提高图像质量。该算法在达到预先定义的迭代次数或预先定义的质量增加阈值时交付结果。不幸的是，这个迭代过程非常耗时，需要CPU的大量资源。图像越大(大型生物、长时间延时等)，处理时间可以延长的时间就越长，从几个小时到几天(取决于数据集)。

Andor实施了ClearView-GPU^TM，在融合和伊万里瓷器我们的采集和图像分析软件。ClearView-GPU是一个基于GPU的反褶积软件。和或´sClearView-GPU反褶积提供的结果比基于cpu的方法快50倍，比其他领先的gpu加速包快10倍，特别是对于较大的数据集，即使禁用迭代加速。

此外，在两者中蜻蜓而且BC43，反褶积可以作为成像方案的一部分被激活，加快了过程，并在采集完成后交付反卷积图像。

由此产生了两个问题:

1-使用宽视场成像和反卷积图像的优点是什么?

重要的是要记住，在共焦图像中增加信噪比的一个固有方面是通过丢弃离焦光来进行光学切片。因此，用共聚焦显微镜拍摄的图像可能比使用宽视场系统时需要更多的照明。这可能导致更高的漂白和光毒性。高灵敏度样品的一个很好的选择是宽视场成像。然后可以使用反褶积恢复生成的图像(图7)。

由于样品不是很厚，宽视场模式是理想的进行成像，曝光时间以及用于获取图像的激光功率可以大大降低。

图7 -使用Andor BC43宽视场成像法获得的哺乳动物细胞图像。图像显示的是宽视场图像，左为去褶积之前的图像，右为去褶积之后的图像。图像是在7um范围内35层的最大强度投影。深蓝色肌动蛋白，洋红色线粒体，黄色微管，青色dna。图片由Claudia Florindo - Andor Technology提供

2 -如果使用广角获取，你可以使用更少的光，用反褶积消除模糊;那为什么不总是使用广角成像呢?

如上所述，共焦成像和宽视场成像都受益于反褶积图像恢复。用户应该决定最佳的成像方式来获取数据，然后对结果图像进行反褶积。图7和图8就是很好的例子。在图7中，宽场模式下的哺乳动物细胞Z堆栈图像得益于反褶积，得到了很好的结果。另一方面，在图8中，我们可以观察到一条粗大的鱼尾在宽视场模式下成像，然后进行反卷积。在这种情况下，很明显，宽视场不是理想的成像方式的样本。

图8- - - - - -使用BC43进行宽视场模式下的平鱼图像，并使用基于清晰视图GPU的反褶积．扁平鱼尾，通过A)宽视野成像方式和B)去卷积获得。宽视场成像方式并不是成像厚样本的最佳选择——尽管图像受益于基于清晰视图GPU反褶积的恢复，但原始鱼太厚了，无法用宽视场成像方式成像。如果使用共焦选项获得原始图像，结果可以大大改善。-见图9。图片由Marco Campinho，阿尔加维大学和Claudia Florindo Andor科技公司提供。

图8中鱼的同一区域也进行了共焦成像，随后进行了反卷积(图9)

图9- - - - - -采用BC43共焦模式下的平鱼图像，并基于清晰视图GPU进行反卷积．扁平鱼尾，通过A)共聚焦成像方式获得，B)反卷积。对于较厚的样品，共聚焦成像方式是最佳选择，基于清晰视图GPU的反褶积进一步提高了图像质量。图片由马尔科·坎皮尼奥，阿尔加维大学和克劳迪娅·弗洛林多，安多尔科技公司提供。

图7、8和9所示的结果显示了反褶积的明显好处，但由于可以观察到较厚的样品(>30µm)，需要旋转盘共焦仪器来去除失焦光并提供更好地代表物体的图像。

重要的是，Andor共焦:BC43和蜻蜓可以成像数百微米到毫米的范围，清晰视图反褶积将始终提高信号噪声和获取图像的分辨率。

总之,反褶积是光学系统中卷积畸变在数学上得到修正的过程。因此，它消除了原始图像的模糊和雾。反褶积，因此，增加信噪比(信噪比)和图像的分辨率。如果一个系统提供反褶积，那么它总是会提高你的图像质量:

“…反褶积方法的应用总是可以提高图像质量，无论图像的来源如何。Deconvolve一切!”

Mark B. Cannell, Angus McMorland，和Christian Soeller，生物共聚焦显微镜手册，第25章

3.安多显微镜系统解决方案概述

安多提供优秀的共聚焦成像系统，适应不同用户的需求和应用。万博电脑网页版登录我们在开发多点共聚焦显微镜的专有技术，确保使用我们的任何系统，用户将受益于:

• 专利均匀照明(Borealis)
• 高灵敏度检测(sCMOS和EMCCD Andor探测器)
• 超高速共焦成像(共焦速度高达400帧/秒)
• 高背景抑制(图像厚度标本从100纳米到毫米范围)

我们提供两种共聚焦成像系统BC43而且蜻蜓．

的BC43是一个高品质的价格点共聚焦系统。这是一个“一体”仪器，简单，紧凑，极其友好的用户。BC43是一种理想的成像主力，适用于多种生命科学应用，可以放在核心设施的角落或实验室工作台上。万博电脑网页版登录了解更多关于BC43的信息．

的蜻蜓是一个高端共焦系统。蜻蜓是一个完整的成像系统，适用于绝大多数的生命科学应用;万博电脑网页版登录从更常规的应用到高端超高速成像，蜻蜓万博电脑网页版登录可以提供所有。了解更多

下面我们给出两个表，可以帮助您选择最适合成像需求的共焦

1-根据应用选择显微镜

2-通过成像技术选择显微镜

请注意，表中列出的应用程序最适合不同的产品。万博电脑网页版登录但是，每个人的实验要求是不一样的，请告诉我们你的具体要求。

3.1应用选择显微镜

注:

1. 取决于激光功率通过样品的深度成像。
2. 取决于吞吐量需求。BC43只有一个摄像头，拍摄速度没有蜻蜓快。
3. BC 43只有4条激光线。空间转录组学通常需要5条线。

3.2通过成像技术选择显微镜

关键:可能，O -也许有可能，所以符合英语习惯的说法是不可能

参考书目

• 田磊，王靖燕，劳拉·沃勒使用LED阵列计算照明的三维差分相位对比显微镜，"选择列托人。39, 1326 - 1329(2014)
• L. Tian和L. Waller，＂LED阵列显微镜定量差分相位对比成像，"选择快递。23日,11394 - 11403(2015)
• Browne M. (2017)，12个原因为什么你的下一个共焦应该是蜻蜓．
• 和或,”ClearView-GPU™反褶积-把这些光子放回他们来自的地方”
• 佛罗里达州，C (2021)，介绍BC43 -新的安铎共焦