与EMCCD相机技术的多色直接风暴

Lampe等人开发了一种新的直接风暴(dSTORM)变种，称为光谱分解风暴(SD-dSTORM)，它结合了红光碳菁染料的光化学优势和光谱分解的原理。具体来说，他们使用了一种新颖的超分辨率碳菁染料组合Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 700，这两种染料都显示了单分子定位所需的优秀缓冲兼容闪烁特性。与其他超分辨率技术相比，SD-dSTORM需要更低的激光功率和更少的成像帧来实现线性和点状生物纳米结构的可靠超分辨率重建。

在目前可用的有机光开关中，碳菁染料Cy5和Alexa 647是最有效的单分子定位。这是基于它们的光稳定性(每个on周期最多可达6000光子)，最重要的是，它们在还原环境中显示长时间OFF状态的能力。Lampe等人想使用Alexa 647，需要找到一个荧光伴侣，既缓冲兼容，又显示一个延长的OFF状态。Alexa 700被选为候选人。结果表明，Alexa 700在100 - 300 mM的β-巯基乙胺(MEA)和氧清除剂中，以及在643 nm激发下，均表现出延长的OFF状态。为了区分Alexa 647和700的重叠发射光谱，我们使用了凯恩研究公司的Optosplit II双通道发射分光器。发射波长通过二色镜(710 dcr)和两个发射滤波器HC 687 / 40和ET 794 / 160分离成短波长和长波长发射，并在Andor的iXon 897 EMCCD上并排检测。每个通道的二色和带通发射滤波器被匹配到单个激光线(643 nm)和发射光谱，以优化光谱分离所需的串扰。

为了评估Alexa 647和Alexa 700的光谱分离质量，微管在BS-C-1细胞中分别用市购的二抗标记每种颜色，并安装在dSTORM缓冲液(MEA, O2清除剂缓冲液)中。采集前，样品用3 - 5kw /cm的光照²在643 nm处驱动荧光团进入OFF状态，直到微管结构溶解并观察到染料随机闪烁。通常情况下，在相同激励下连续运行EMCCD可获得5,000 - 20,000帧。采集后，使用开源软件rapidSTORM确定整个双通道视图上的单分子定位和它们各自的强度值。Lampe等人使用自己编写的自定义算法得到了完全重建的双色SD-dSTORM图像。

图1. SD-DSTROM重建微管。微管与Alexa 647（红色）或700（绿色）分开染色，并用SD-DSTOM成像。Alexa 647（红色）和Alexa 700（绿色）定位的强度值显示了2D强度直方图中的不同群体。基于强度的颜色分配过滤器丢弃串扰区域（灰色）中的本地化。

为了确定两种颜色SD-Dstorm系统的实验光学分辨率，成像了SD-Dstorm中单分子定位的散射（图1）。从该分析，本地化集群出现为完全分开的斑点，展示了频道之间交叉谈话的低概率。对于Alexa 700的Alexa 647和30nm的两个通道，22nm的分辨率与使用Alexa 647作为定位显微镜的荧光团的先前报告的分辨率非常相似。

通过成像亚细胞对象证明了SD-Dstorm在细胞生物学中的适用性，该物体已知具有用alexa 647和alexa 700标记的不同的二抗体显示不同的副抗体和空间定位。局部粘连，细胞周边的大蛋白质复合物，和Clathrin涂层坑，选择了大约150nm尺寸的血浆膜的脉冲对象。两者都不彼此共定或用微管，因此应显示为单独的亚细胞结构。双色SD-Dstorm显示出良好的分离的超分离的微管和局灶性粘附（图2A）和良好的分离的微管和Clathrin涂层凹坑（图2C）。作为对照，用Alexa 647和Alexa 700标记微管，以显示两个通道的共定位（图2b）。

图2.单独和共定结构的SD-Dstorm重建。用Alexa 647（红色）和局灶性粘附（A）或克拉替纳重链（C）或微管（B，用于分层化测试）的微管染色，用alexa 700（绿色）染色。秤条=1μm。

Lampe等人在用户友好的多色单分子超分辨率显微镜方面取得了重大进展;它结合了红色碳菁染料的优点和光谱分离的原理，实现了高效、可靠、快速的多色dSTORM。在光谱分离的基础上，SDdSTORM提供了使用其他相关红色染料(即Alexa 750)扩展到两种以上颜色的可能性。SD-dSTORM可以与任何商业化的本地化软件(例如QuickPALM和rapidSTORM)结合使用。如果结合标签技术，SD-dSTORM有望成为活细胞成像的一大优势。

在Jan Schmoranzer和Andre Lampe的实验室中，多色直接风暴的设置展示了iXon3 897和OptoSplit II。

研究论文:多色直接风暴与红色发光碳菁，细胞生物学(2012)，DOI: 10.1111/boc.201100011。