分子机制在作用-高分辨率时间延迟成像在活细胞

自旋盘共聚焦显微镜在生物医学研究中的应用

的莱顿大学医学中心细胞和化学生物学系教授(CCB-LUMC)旨在揭示细胞功能的关键分子，并了解它们在疾病中的扰动。最终的长期目标是将新兴的知识和技术转化为临床实践。为了适应这一使命，研究范围从对细胞生物过程的基本理解到复杂细胞系统(如类器官和组织)的化学操作，为干预疾病铺平了道路。这项研究跨越了生命科学的几个学科:病毒和膜生物学、化疗的细胞生物学、致癌信号传递、糖尿病中的抗原提呈等。

选择相关的学习方法分子机制在起作用是live-cell成像使用共焦显微镜．的安多蜻蜓自旋盘共聚焦广泛用于LUMC细胞和化学生物学系的各种研究项目。CCB部门使用延时显微镜了解细胞生物学过程和细胞、细胞器和分子的时空行为，从而提供相对于使用固定样本获得的更多信息。

使用crispr介导的敲入技术，这正在迅速成为标准实践，协同共焦时间推移成像，以允许观察活细胞中的内源性荧光标记蛋白。然而，由于knock-in(s)受内源性启动子控制，其表达水平通常较低，特别是与异位(过)表达水平相比。因此，CRISPR敲入分析需要一个能提供极其灵敏检测的显微镜。

此外，对organellar行为还有研究有丝分裂细胞遇到与迭代采集速度和光毒性相关的额外技术挑战。

“在不影响获取速度的情况下，Andor蜻蜓为我们提供了灵敏度和光毒性挑战的解决方案。”

莱纳德·沃特曼博士，莱顿大学医学中心细胞和化学生物学系

图1 -安多蜻蜓500在莱顿大学医学中心的光学显微镜设备

细胞与化学生物学系(LUMC)研究项目

在本节中，我们将介绍来自实验室的几个研究项目的概述Jacques Neefjes教授而且Huib Ovaa教授在CCB-LUMC。这些项目从细胞生物学的基本机制来转化研究，采用现代显微镜和分子生物学技术，使用蜻蜓旋转圆盘显微镜。(关于蜻蜓旋转盘的概述，请阅读布朗M.， 2017）

项目1)-细胞内运动如何调节以支持细胞器功能?

细胞器通过细胞空间运动的复杂性与其功能状态密切相关。运动细胞器(线粒体、核内体、溶酶体和自噬体)和感染因子(包括细菌和病毒)沿着微管移动。这种运动是以双向走走停停的方式完成的，由驱动蛋白马达和动力蛋白马达驱动。

一些生物学问题仍未得到解答:

• 双向运动到底需要什么?
• 双向运动是如何调节以支持细胞器功能的?

为了回答这些问题Neefjes实验室制作了几个双色敲入细胞，监测双向运动通路的不同潜在成分。敲入的例子包括内源性马达(KIF5和动力蛋白)，或晚期内体效应蛋白(RILP和FYCO1)。晚期内体蛋白作用于众所周知的小GTPase Rab7的下游。另一个使用的工具是细胞系，所有的囊泡都被标记;这种细胞系的使用将允许分析细胞中囊泡的“拥挤性”。

本研究项目的成像将使用延时显微实验活细胞其次是广泛的图像分析．这项工作的最终目标是了解细胞生物学中双向细胞器运输的基础。(如图2所示)

在类似的研究中，专门针对去泛素化酶USP32的化学抑制剂与细胞系结合使用，以化学方式扰乱细胞内运输途径。去泛素化酶USP32调节Rab7功能(Sapmaz & Berlin et al, 2019)。

综上所述，利用各种化学生物工具Ovaa实验室Neefjes实验室将继续解剖细胞内细胞器双向运动机制。广泛的活体成像显微镜将需要推动该项目向前发展。

图2 -代表性蜻蜓500双向运动和细胞器动力学共焦图像。表达mCherry-Rab7或其突变体的活HeLa细胞的代表性共聚焦图像，以及Arl8b-GFP (绿色)，在延时开始时拍摄(t₀）.右面板: arl8b阳性囊泡在持续50秒的时间间隔内以每帧0.5秒的速度记录的轨迹。在Dragonfly500上收集时间延时，并使用斐济的TrackMate执行囊泡跟踪。图片改编自Jongsma, Bakker等人，EMBO杂志2020

项目2)-内质网结构是如何调节的?

内质网(ER)是细胞内的中心隔间，可以与每一个细胞内的细胞器相互作用。ER是一种复杂的生物合成细胞器，也分泌乙二醇脂质和离子，并将钙信号和代谢信息转导到其他细胞器。为了区分和促进这些不同的功能，ER拥有密集的核周部分和更管状的外围网络。

研究结果已发表于EMBO报告(Spits et al.， 2021）并介绍了用自旋盘共聚焦显微镜拍摄的近50部电影蜻蜓旋转圆盘显微镜．

项目3)-了解细胞分裂过程中的细胞器组织和运动。

核内体提供膜和蛋白质成分，对成功的胞质分裂和脱落至关重要。Neefjes实验室最近发现了一种er嵌入的泛素连接酶，它控制着内溶酶体途径的核周位置(Jongsma & Berlin et al.， 2016)。对这种本地化的控制是有效和及时的货物交换的关键因素。然而，我们预计在有丝分裂中，这种室间组织(即内质网和核内体之间的相互作用)可能会丢失，以促进胞质分裂和内溶酶体系统向新生子细胞的分布。

为了进一步了解核内体(和其他细胞器)在有丝分裂过程中的时空组织，以及ER的影响，基因组编辑技术将与旋转盘显微镜结合使用，实时跟踪荧光有丝分裂细胞。研究人员Ilana Berlin和Lennard Voortman-加上"该企业将需要大量的显微镜延时成像，这是蜻蜓共聚焦的一个关键应用”。

参考书目

• 布朗,(2017)12个原因为什么你的下一个共焦应该是蜻蜓．
• Sapmaz & Berlinet al .,(2019)USP32通过Rab7的去泛素化调控晚期内体转运和循环自然通讯V10 pg 1454
• Spits et al.， (2021)活动晚期内小体调节外周内质网网络结构Embo报告e20815
• Jongsma和Berlin等人，(2016)er相关途径定义受控货物的核内体结构运输细胞V166 pg 152
• Jongsma, Bakker等人，(2020)SKIP‐HOPS招募TBC1D15进行Rab7 - Arl8b身份开关，以控制核内体晚期转运EMBO期刊v39 e 102301