2 -透射光显微镜显微镜学校课

你好。非常感谢你加入学校和或显微镜。今天我将和你谈话透射光显微镜。透射光显微镜是什么?透射光显微镜意味着光线传播从源到镜头。和通过这样做还通过样本。这个方法是非常有用的区分的形态特征和光学观察材料。它还提供了一个额外的频道,提供了上下文荧光染色。最重要的是,由于非常低的能量用于透射光显微镜技术,它们是非常有用的对于生活的成像实验。所以要记住这是一个很好的技术。 And when chosen appropriately, the transmitted light microscopy technique to use can be extremely useful for your research applications.

在今天的会议中,我将谈论……我把它两个部分。和第一部分将在显微镜的一般概念。我将讨论光学仪器,解剖显微镜下,是什么在客观,光学畸变,显微镜的分辨率。然后我将讨论透射光显微镜技术。我将解释brightfield,暗视野,相衬,DIC技术。所以,从第一部分开始我们的研讨会,在显微镜的一般概念。开始前介绍大多数显微镜的一般概念,我想今天跟你说话,我会请先停止和你谈谈你需要采取的预防措施的光学仪器。

光学设备容易损坏和敏感,一旦损坏,你可以摧毁你的图像质量,直到永远。所以请注意,从来没有污点,扭曲或下降的目标。不要强迫冷凝器的目标的控制。和总是看镜头表面的标本为了不损伤不可逆,客观。和不要触摸光学表面用你自己的手。所以请注意,当你在做一个显微镜实验中,一个句子,在=垃圾的垃圾。你就不能有一个不错的图片如果你没有很好准备样品。和有一个非常充分的准备样品,一切,从当你修复你的样品,当你染色样品,样品你山。所以的封面滑落你的幻灯片,幻灯片的厚度和求职将计数。所以选择玻璃幻灯片1毫米厚。

和目标的设计,优化了0.17毫米厚度的玻璃。所以最理想的成绩目标是1.5。和你可以检查哪一种客观你使用如果任何机会是不同的。超分辨率,注意选择1,5 h目标,高质量的目标,这将有更加严格的厚度0.17到0.18毫米厚。所以请记住,一切当你准备样品。求职的厚度涂涂画画,将计数和影响最终良好的质量形象。

所以通过解剖显微镜下,所有这些部分的名称是什么在显微镜吗?这些是目镜。这是炮塔或鼻甲。这里是目标。这是显微镜阶段,试样夹。大按钮,粗的焦点,和小一个是细焦点,将允许您粗糙集中,迅速移动阶段。和焦点,移动舞台更慢,当你接近集中样本。然后是电容器,它是一个镜头……对透射光下的阶段。我们会集中在提高分辨能力的一种方式。但是我会说一点冷凝器。 So, the diaphragm of the condenser and the condenser itself.

然后你有这里的旋钮,让你专注冷凝器,和这一个和这一个是冷凝器定心螺丝、隔膜,和透射光控制。也可以使灯。一般的对齐控制灯的显微镜。所以,我将在这部分谈论更多的显微镜下,冷凝器。所以,如果你看横隔膜的电容器和电容器。隔膜是像一个虹膜,打开和关闭,允许更多的光通过冷凝器样本或更少的光。因此,电容器是什么?为了增加目标的孔径和显微镜的分辨能力,冷凝器底部的舞台上添加。冷凝器的作用是将增加光线的角度捕捉到的示例,因此,它会增加灯的角度将被客观增加因此分辨能力。

那么,什么是之间的关系电容器和电容器的数值孔径?冷凝器,光经过冷凝器,数值孔径。如果你增加冷凝器的数值孔径,你希望观察的锥光经过冷凝器?所以当我们增加电容器的数值孔径,更多的光通过冷凝器的示例。和客观的数值孔径是定义的方程。数值孔径是N,α的折射率的罪,这是一半的更广泛的角度所捕获的目标。因此,数值孔径与决议直接相关。高数值孔径应该对应更高的分辨能力。

所以我有这张图片的东西。珠,用于图像,然后进行测试,不同的数值孔径图像一模一样的样品。你认为它会发生什么当你增加这个目标可视化的数值孔径样品吗?当你增加物镜的数值孔径,你增加了……你更广泛的角度光线捕捉到同一个目标,因此你提高分辨能力。所以我们从一个blob,我们不知道那里有什么,发现我们有四个节拍blob。高数值孔径的值将允许更高的分辨率。较小的结构会因此可见高质量,和分辨率实际上是能够区分两个亲密点分离。

继续讨论决议,为什么你认为是石油使用的目标?油是用来延长显微镜的分辨能力。但是为什么呢?为什么会发生?这是因为玻璃的折射率为1.51。和石油,也有玻璃的折射率,因此没有任何光线的衍射,光和更广泛的角度将被捕获导致增加的分辨能力。所以我将解释我刚才提到的图像。你有这里的光源,幻灯片和示例,盖玻片。这是一个空气盖玻片和客观。当光源,这是更广泛的角度,空中目标能够捕获、和其他人将折射和绕射,将无法被捕获的目标。

另一方面,如果我们使用石油,折射是次要的。还有一个更广泛的角度的光将被捕获的目标,因此光锥所捕获的目标是更大的,这将会增加目标的分辨能力。这是一个原因石油中使用显微镜。所以现在经历分辨率之间的关系,数值孔径和焦距。正如我在前面提到的,数值孔径与折射率有关,sinα,一半的角度更广泛的角度可以捕捉到目标。如果你增加数值孔径,降低焦距能够捕获一个更广泛的角度的光。因此,您需要注意,要分析一些样品适合较低数值孔径,但不会适合极高数值孔径时,工作距离很小。

其他实用,非常简单的建议,但有时人们忘了,提高分辨率和显微镜的分辨能力,请注意,你应该清理目标。当你成像的目标应该是一尘不染的干净和样本的准备工作也应该干净。请注意,正如我在前面提到的,有盖玻片和幻灯片使用正确的厚度和使用正确的石油使用正确的折射率和正确地使用它。所以更多的谈论的目标。显微镜上的目标是至关重要的组件。和目标是比这更多的镜头前面。里面有很多单独的部分。当你看到这里的目标,你将有目标类型。这里有金色的参考,你可以用这个号码和检查制造商网站到底是什么这一目标。

这是浸媒体这一目标。这个目标能让三个不同的浸媒体与调整各自的浸没式媒体的颜色一致。通过切片客观在中间,看着他们的框架,我们可以看到,他们是非常不同的内部,不仅仅是一个单一的镜头前面。他们也有萤石和高度消色透镜,弯月透镜,然后他们有镜头的叶片,叶片镜头的数量将取决于目标的修正以及三联体镜头。和所有的这些会如何影响最终结果的客观可以提供什么?问题是为什么那么多镜头和光线发生了什么当他们穿过玻璃吗?它会影响显微镜图像?如何?畸变校正的目标之一是菲尔德的曲率。场曲率是什么? If the objectives are not corrected for field curvature, it is not possible to focus the entire field at the same time, meaning that either we focus the center of the sample or the edges because there are different focal points of rays of light because this objective is not corrected for field curvature. This is an off-axis effect of the lens when it's not corrected.

其他目标是球面像差畸变纠正。球面像差发生不均匀集中的单色光,由于曲率的透镜单色光。你可以看到,这些光线,它们不是集中都完全相同的地方。这将导致图像出现或略有点模糊的焦点。有时这也可以通过调整纠正盖玻片的厚度或调整样品的折射率。其他修正目标是色差校正。是不同波长的光会发生什么如果不纠正目标将集中在不同的飞机。

因此,non-corrected透镜,在Z轴,将显示一个点应该colocalize colocalize应该的多色珠子,所有的颜色在同一个平面上就好像它们是在不同的Z平面。另一方面,如果目标是纠正,所有不同波长的光线将集中在同一点上,因此多色珠子,所有的颜色将会出现在相同的Z平面。所以,如果你的目标是纠正,请检查,如果你使用正确的石油来纠正折射率不匹配,这也可能导致一些色差。所以,当加入所有的知识在一起,发生在不同的目标和纠正的颜色是什么?消色差物镜,场曲率不纠正,纠正对球面像差对一种颜色和两种颜色的色差。

胶体的计划目标,场曲率修正,球面像差,一个颜色和色差,两种颜色。萤石,场曲率不纠正。球面像差,两到三个颜色,色差,两到三种颜色。一锅萤石和计划高度消色透镜,场曲率修正。球面像差的校正在他们两人三到四种颜色。但不同的是色差。计划胶体有四到五个颜色色差校正,而在平底锅萤石有两到四个颜色修正。目标的价格将增加的镜头内部和修正的数量。所以您需要考虑目标你需要特定的实验或应用程序。万博电脑网页版登录

所以,明智的选择。我的意思是什么?所以,几年前,我记得我是在工厂工作,π的来找我,告诉我,”克劳迪娅,我想要一个40 x的目标。”At the time, I went back to him and say...and told him, "What do you need to do?" Because if you go to the website, you see that there are 42, 40X objectives in 2012. Now, I actually did the same search in the same website and they are 99, 40X objectives. And the problem remains how to choose. Even more surprisingly, if you go for 63X objectives, you have more than 260 objectives that you can choose from. So, how do you choose? With such a large variety of objectives they are obviously different for different applications. It's extremely complex to select an objective.

所以请考虑以下参数时你会选择一个目标。检查放大。这是我们的第一部分,那么你需要数值孔径?你的样品是什么工作距离非常大吗?你需要工作非常远离你的样品或者你想工作非常接近你的样品吗?你需要什么修正平场,颜色修正吗?波长传输需要,传输和透射光技术,你需要什么?你需要brightfield吗?你需要暗视野,相衬,DIC ?荧光,你需要什么? What transmissions do you need? Is it a water immersion objective, oil immersion, glycerol immersion? What thickness of coverslips are you going to use? It is corrected? Can it be corrected? So you need to consider all of these parameters when you're choosing an objective.

现在,我要谈谈透射光技术本身。正如我所提到的在谈话的开始,透射光技术代表一群技术的光穿过源,通过样本,并捕获的目标。它是有用的。它提供了一个额外的通道,荧光显微镜,但也……它是一个独立的技术,可用于实时成像或形态学分析样品的正确选择。

在透射光显微镜,这是我们的海拉细胞染色…非彩色的。这是一个brightfield形象。但实际上细胞大部分时间非常透明,他们没有足够的结构提供必要的细节我们的眼睛可以看到。为了形象一些标本或样品,如细菌、活细胞,或薄的组织切片,研究人员有时使用其他透射光技术或染色样品。今天,我要和你谈谈brightfield,暗视野,微分干涉相衬,DIC,对比。所以你需要做的一件事……你应该做当你要获得任何成像透射光显微镜,开始收购图像之前,检查你的显微镜有适当的科勒照明对齐。该方法给出了一个非常甚至照明你的样本,因此得到的图像会好得多。而且,科勒灯饰做的事情之一是,你不会看到灯泡的灯丝的形象。

所以比较照明计划科勒对齐时,如果你有这里的光源,这里有光的焦点,集中在示例中,它是集中在视场光阑,它将集中在你的眼睛,在视网膜上或被俘。另一方面,灯灯丝,这里的重点,重点是前焦平面的冷凝器,在物镜的后焦面,之前捕获的图像。因此,焦点平面灯灯丝不同于焦平面的样品。所以你可以带一个漂亮的图片样本没有图像的干扰你的灯丝。所以如何在显微镜下对齐科勒照明。你做的第一件事就是使用聚焦旋钮,你把样本成为关注焦点,然后关闭隔膜,你关闭的NA冷凝器。

如果它出现了,一个六边形,与你的样品里面,一切都很好,是锋利的,所以你有适当的科勒照明。很多时候当你关闭隔膜,看起来黑了,你几乎可以看到样品。所以你会怎么做?你需要第一个中心现场隔膜与这些螺丝。所以我中心隔膜。然后使用这个电容器的聚焦旋钮,你将会与冷凝器急剧向上和向下,直到你关注这些边缘。一旦集中边缘,你打开略冷凝器和隔膜和一切都应好。如果你使用DIC,你也想调整沃拉斯顿棱镜的目的:增加你的对比。

所以对比亮视场图像是由不同的光吸收,折射率,或者颜色。它收购了光通过样品改变其方向。所以在很薄的样品,他们将会非常透明。其中一个方法来增加结构的可见性与brightfield成像时是使用光吸收染料曙红和苏木精等。请注意,你需要做适当的brightfield形象。除了行善科勒照明,您需要匹配电容的数值孔径的数值孔径的目标。因为如果你把太多的光从冷凝器目标,目标将无法捕捉一切。我设想如果看太阳,我们有很多,但是如果你直接看,我们有如此多的光,除了盲目的,我们不能看到任何细节。所以你需要电容器的数值孔径匹配你的目标,因为它的数值孔径就是你的数值孔径的光量的目标可以捕获的数值孔径匹配我的眼睛,太阳的光线是发送给我,我们所有人。

所以,这是一个40 x客观的数值孔径冷凝器最大值。这是我能够获得的图像。但是如果我减少冷凝器的数值孔径,可以看出这是完全相同的拍摄一个接一个。实际上有一些。也许如果你现在看起来很强烈,你有一些结构,你可以看到,这里有东西。我可以增加这个吗?是的,我能。如果我把电容器的数值孔径匹配的数值孔径40 x客观,我能看到更好的相同的样本。这就是我的意思是,你需要与…做brightfield图像时,您需要匹配的数值孔径冷凝器的数值孔径的目标。 And when you change objective, you need to adjust that again in a way to have the best image possible. It will always be a very transparent sample and then brightfield. But in this case, I can see whereas in this case, I couldn't.

这是相同的图像,你可以看到一个更广阔的视野与科勒brightfield元素的适当调整照明和冷凝器的数值孔径物镜的数值孔径匹配使用获取的图像。brightfield显微镜的优点呈现在它的简单和容易的调整需要做一个很好的brightfield形象。这也是一个非常便宜的技术的光学brightfield所需。缺点是很多样品实际上是对brightfield几乎透明的。我们可以避免染色样品的光吸收染料苏木精和伊红等。或者如果我们不想染色的样品,我们需要借助于其他透射光技术,我将进一步解释。

现在,谈论暗视野图像。这是两个眼睛的图片鼠标暗视野与彩色摄像机和花粉在暗视野,暗视野图像,暗视野技术。这些非常漂亮的彩色图像就是你现在观察。黑白摄像头,你可以看到相同的样本在被收购之前brightfield或暗视野。所以实际上,细胞的光芒,而背景是黑色的。所以暗视野的原理类似于一个eclipse的原则。当你看到月光下,天上的星星会出现可见的。黑暗的背景将增强模糊对象的可见性。所以使用暗视野、透明样品没有任何染色可以轻易看到。这是一个图形显示brightfield照明的光线会发生什么。 We have the background and diffracted light, the diffracted wave, and then the specimen wave. And this is why it's really hard to see in background...in brightfield in same samples because the specimen wave is quite close to the background wave.

另一方面,为了产生对比对象,在暗视野照明,标本波和绕射波非常接近一个到另一个。这就是被目标。因此,背景波是选择性地照亮。这就是为什么你看到它在一个黑色背景。和它是如何发生的?冷凝器之前,有一个视场光阑能让光线进入冷凝器在一个角度,当他们进入样本,这是客观的,这是样本平面,只有衍射的光会被目标和其他光中输入一个角度是排除在目标。因此,你只能看到穿过样品衍射光,和所有其他的……将显示在一个黑色背景。

因此,当使用暗视野照明。暗视野照明是非常有用的为低的放大40 x客观因为冷凝器的数值孔径需要高于物镜的数值孔径为了暗视野照明。如果你希望看到的一切液体样本,暗视野是完美的解决方案…给你。缺点有时候真的是你看到的一切。甚至微小的尘埃颗粒非常明显。因此,如果你的样品…如果你想图像样本,并不干净,图像会发生混淆,因为每件小事在你的样品将是可见的。他们很容易获得正确的焦平面图像在一个非常低的放大和非常小的很好或很低对比样本。

所以相衬显微镜以及暗视野和dic在显微镜诺贝尔奖。我必须说显微镜是一个神奇的领域,因为它是不断发展的。和科学家发现新的方式方法,为我看到看不见的突出。回到相衬显微镜,相衬显微镜可以想象原本看不见样本通过干扰而不是吸收。你可以看到很多明显brightfield相比,非常透明的样品。在这里,再一次,同样的图片,它看起来就像我们之前看到的很好。brightfield和完全相同的,你可以看到它是相同的细胞是这里的末期,在那里,它是完全相同的照片……不一样的照片,同样的样本用brightfield或相衬。你可以看到,在相衬,你看得清楚。

相衬会相环下面隔膜以创建所需的干扰,然后一个相位板上方的目标。所以相环,冷凝器,样本目标,和相位板。现在这张图会比较发生了什么标本波相衬下照明。这是标本波在brightfield照明,正如我之前提到的,相当接近背景波。这就是为什么很难看到结构brightfield照明。但是相差照明,干扰原因的进一步分离标本从背景波浪潮。这将使样本更明显。

相衬显微术的优点是可以想象在brightfield结构,否则会看不见的。这将包括一些细胞器,以前无法观察。因此,图像会更好看,由于这种技术能够捕获的细节。移动到另一个透射光技术,我将谈论DIC,微分干涉对比。,在DIC,无形的特性的样本都是可见的。它有一个非常复杂的光学,允许获得样品的光密度的信息。图像将类似相衬显微镜,但它没有特点的阶段晕相衬的图像。

这阶段光环,这是一个明亮的光环和经常出现在样品可以非常具有破坏性的,破坏性的。这技术……理论是在1955年出版。在这里,你可以在这里比较亮视场图像在DIC的形象。我真的爱DIC。如果你可以看到很清楚,如果你看的细节,你可以看到,这些染色体,这些是中心体。在这里,你甚至可以看到轴。我这张照片的时候,实际上,我costained DN DAPI和α-微管蛋白和γ微管蛋白。我可以很清楚地确认我说的是真的。这是一个有丝分裂细胞,染色体,微管和中心体。

迪拜国际资本,它是如何工作的呢?它将为正交偏振光线。他们穿过样品在同一平面,结合之前的观察。和干扰的两个部分组合时将敏感的光路光穿过,将导致一种三维结构,允许您可视化很好看到内部细节……以前透明的样品和清白的。在光学方面,你有光,有一个偏振滤光镜,沃拉斯顿棱镜把光线。他们通过冷凝器和样品分离,将捕捉到目标分离。然后有一个沃拉斯顿棱镜,加入他们,和极化滤波器,然后图像将被我们的眼睛或相机。

这是沃拉斯顿棱镜调整的差异。我不知道你是否还记得当我说讨论的开始调整科勒照明。之后我提到调整科勒照明在DIC进一步对比图像,您可能想要调整的沃拉斯顿棱镜的最高目标。这是完全相同的样品,我已经获得了沃拉斯顿棱镜非调整和沃拉斯顿棱镜调整。所以当你比较DIC和相衬,实际上产生了更高的分辨率的图像。它显示了很好的对比。迪拜国际资本可用于厚样品和它没有相衬显微镜的分散晕。所以DIC实际上是一个极好的透射光显微镜,但光学技术是复杂的,它实际上是最昂贵的。

总之,从我们今天的课,我希望你能记住要谨慎地使用设备和尊重,选择正确的目标,油,和盖玻片为您的特定应用程序,选择正确的透射光你会使用对比,暗视野,brightfield,相衬,DIC。如果你没有看到它,检查你的科勒科勒照明照明,并正确地对齐。如果你的形象仍不好,试着调整电容器的数值孔径,滤光片,清洁镜头和清洁你的样品。