显微术学校第6课-共聚焦显微术原理

我是克劳迪娅·弗洛林多，今天我将给大家介绍共聚焦显微镜的原理。为了总结今天的演讲，我将快速回顾荧光显微镜，然后我会介绍什么是共聚焦显微镜。接下来，我将解释点扫描显微镜，针孔，什么是针孔，旋转圆盘共聚焦显微镜，以及根据您将要使用的应用程序选择哪种显微镜。

快速回顾一下荧光显微镜。正如我在前面的演讲中提到的，我们有光源和滤光片立方体，分别具有激发、二向色和发射滤光片。光线通过光源，被二向色镜反射，到达样品，样品将穿过二向色镜的光线反射回来，这是第二个屏障发射滤光片然后被探测器捕获。

这意味着，在这个设计中，探测器在侧面，光源在顶部。这意味着在样本中，样本中来自所有平面的光，聚焦平面和其他非聚焦平面，都将被探测器捕获。

这张示意图显示了在荧光显微镜下捕捉到的东西。例如，我们有来自焦平面的光在细胞中间的Z部分，但是探测器也能捕捉光并且会捕捉来自焦平面上下平面的光。想要让图像更清晰，然后提高信噪比和图像分辨率的方法是避免失焦光，只捕捉特定焦平面上的聚焦光。然后为了捕捉所有的细胞，我们需要找到一种方法使焦平面通过细胞的所有Z部分。

这是宽视场显微镜下肾脏组织切片的一个例子，这就是我们想要的避免这种失焦光，这种雾霾会随着样本变厚而变得更加明显。这是宽视场图像，这是共焦图像。

但另一个问题是如何在二维成像系统中获取三维图像。正如你在这里看到的，我们有一个果蝇卵室的3D图像。事实上，为了制作这张3D图像，我们已经获得了424张图像。我们得到了一个平面，把舞台移高一点，得到了另一个平面，一个又一个，一个又一个，绿色的是424，红色的是424。

如果我把我的424张图片并排整理，你就能看到我为做这个果蝇卵室的3D图像而获得的所有图像。我还将这424张图片按10 × 10的步骤组织起来。这是1号，这是10号，这是20号。你知道为什么吗?你可以清楚地看到Z步在我们得到的所有图像中。然后我们可以想象这个三维堆栈经过Z轴。

所以，现在，我们正在通过果蝇卵室的3D堆栈的Z，并分析我在之前的画廊中获得和曝光的所有部分。

现在，我可以用电脑软件对样本进行三维重建并在任何方向上分析样本，在Z轴上，在Y轴上，并从内部进行可视化。要做到这一点，用共聚焦显微镜获取图像是很理想的，特别是在厚样本上，用适当的Z采样方式获取图像，当你从一个Z切片到下一个Z切片时，你有所有你需要的信息，之后，能够重建你的3D图像。

所以，在某种程度上，共焦图像就像一本书。我们有这本书的很多页，每一页都显示了一些你可以阅读的信息，就像我在之前的图片中给你看的那样。阅读一本书中的一页可以让你对该页上的信息有一个概念，但不能让你对这本书有一个全面的了解。所以要看到整本书，看到整个样本，看到整个细胞，你需要获取所有的切片，你需要阅读书的所有页面，然后进行3D重建。

现在的问题是共焦像是如何形成的。比如，我们如何移除失焦的光，这样你就可以进行适当的3D重建，并在你的样本中很好地可视化?

为了获得共焦图像，我们有这个果蝇胚胎，标本。对于常规的荧光显微镜来说，它太厚了。这就是我想观察的区域，胚胎内部的区域。

如果这里有一束光，我将光聚焦到我感兴趣的区域，进入物镜，共焦有一个针孔，可以让聚焦内的光通过探测器被捕捉到。但是如果……这是对焦光。在这里或这里的光线会发生什么?它们也会被探测器捕获吗?

这是我之前给你们看的感兴趣的区域，它穿过针孔，它在探测器里，但如果有荧光来自另一个区域它在穿过物镜时没有聚焦，它就不能聚焦到针孔并通过探测器，所以这束光就被丢弃了。所以只有被聚焦的光才能到达探测器。这将创建一个高信噪比的图像。

再一次，我们有激光，进入分束器，被反射到物镜上，有几条射线。我们有聚焦内的光穿过物镜到达探测器，但也有聚焦外的光穿过物镜但没有到达探测器，因为针孔会起到阻挡物的作用，不让光到达探测器。如果这是一个epifluorescence显微镜，所有的光都将到达探测器，图像将更加模糊。

总结一下，在传统光学显微镜下，想象我们正在成像这块珠子这实际上是聚焦区域。在传统光学显微镜下，这就是我在视野中看到的东西。在共聚焦激光扫描显微镜或旋转圆盘显微镜中，这是聚焦深度，这是视场中的图像。我已经删除了所有的珠子是不聚焦，只有图像的焦点珠子。

这就是为什么在这张图像中，你可以看到有很多雾霾的广域图像，来自焦点平面上下的平面的失焦光。在共焦图像上，你会看到一个清晰的图像因为失焦的光被针孔拒绝了。

这是光源，激发进入物镜这就是果蝇胚胎。所以果蝇胚胎所有平面的光都会被探测器捕捉到，但实际上只有这个橙色是聚焦的。在共聚焦显微镜中，也会有来自所有平面的光，来自聚焦平面和非聚焦平面，但只有聚焦平面才能到达探测器。激光扫描，点扫描显微镜中的探测器实际上不同于宽视场显微镜中的探测器它是PMT。不需要使用相机，因为扫描是逐点逐点的，所以不需要同时扫描所有的样品。同时，这些检测器需要快速，因为我们要逐点扫描样本。简单讲一下它们的工作原理，入射光子进入阴极，阴极将光子转化为电子。一旦它转化成电子，它就会到达电极。电子将到达几个电极，当它们到达电极时，它们将能够跳出其他电子，将单个光子的信号放大很多，最高可达一百万倍。现在可以读取信号，激光可以移动到样品上的下一个点。

在点扫描显微镜中，针孔可以调整到物镜，甚至在单个物镜中，我们可以调整针孔的大小，这是共聚焦扫描显微镜的一大优势。但是在实际中，调整，增加或减少针孔的大小意味着什么呢?如果我增加针孔的开口，它对图像强度和分辨率有什么影响?如果我增加针孔的开口，我将允许更多的光进入样品，因此，我增加了强度。通过增加针孔，来自共聚焦的Z截面也将增加，因此更多来自失焦平面的光也将到达探测器，因此，I将降低分辨率。另一方面，如果我关闭针孔，更少的光会到达探测器，所以我将降低强度。但是通过减小针孔，我也增加了共聚焦减小了到达探测器的焦平面，因此，我将提高分辨率。

总的来说，点扫描器的工作原理是逐行扫描直到用电反射镜形成一个图像，通过二向色线移动它，通过PMT放大信号，形成图像。虽然pmt在瞬间检测到一个点的信号非常快，但点扫描仪仍然需要一行一行地扫描，直到形成图像。因此，扫描速度是点扫描共聚焦的一个限制因素。

作为一个点扫描器共聚焦总结，形成图像的过程是激光束激发样本中的一个点。它也会无意中激发样品中的其他点，但只有聚焦内的光被光电倍增管检测到，因为聚焦外的光被针孔拒绝。由PMT检测到的光与监视器上的图片相关联，就像你在这张图片中看到的那样，然后激光束会移动到下一个点，另一个像素将被收集。

同样，虽然pmt非常快，但这将使点扫描共聚焦成像比宽视场图像慢。

问题是，如果有……如果有另一种方法来获得共聚焦成像，而不必逐点扫描图像?答案是肯定的，这是用旋转圆盘共聚焦显微镜完成的。因此，旋盘共聚焦和点扫描共聚焦两种系统都有各自的优缺点。现在我要介绍旋转圆盘共聚焦显微镜。

正如我之前展示的，点扫描器通过收集单个针孔的光来工作。另一方面，我现在要介绍的旋转圆盘显微镜，会收集多个针孔的光。

举个旋转圆盘的例子，我要给你们看双微透镜系统。激光来了，就有了旋转的微透镜。旋转磁盘之所以这样命名是因为有针孔的磁盘，它旋转得非常快，速度取决于制造商，但在双微透镜系统中有一个收集器磁盘可以让光聚焦，激光聚焦在针孔上。无论是收集器盘还是针孔盘，它们都必须旋转得非常快，但必须是同步的，以一种透镜……被透镜聚焦的光会到达针孔。在一个旋转的磁盘中同时扫描多个针孔，随着磁盘的旋转，图像瞬间形成。由于磁盘在旋转，多个针孔同时被扫描。在旋转圆盘中，探测器是一个摄像机。

比较自旋盘共焦和点扫描共焦，自旋盘是自旋的，图像形成得很快，而在点扫描共焦中，没有自旋盘，只有一个针孔，还有一个激光逐行照射形成图像。在旋转圆盘中，探测器是摄像机sCMOS或emccd。在点扫描仪上，探测器是我前面描述的pmt。如果你想了解更多关于相机的知识，你有以前的课程或这门课程，相机技术和探测器的解释。因此，相机实际上更有效地收集从样品中发射的光子，达到90%的量子效率，而pmt的效率比相机低。

那么旋转圆盘共聚焦的挑战是什么呢?事实上，图像样本的一个样本的信噪比是很高的…如果标本的背景较低，则值较高。但如果背景高，我们肯定需要共焦，但在旋转磁盘中存在挑战，而旋转磁盘中最大的挑战是由于磁盘有多个针孔，如果针孔没有适当的大小或间距，我们可能会有针孔串扰，我们将失去共焦，我们将获得来自邻近针孔的失焦光。这实际上是在传统的旋转圆盘共聚焦上，这实际上。针孔串扰实际上开始出现在超过30微米厚的样品中。它们对于较厚的样品并不那么有用。

这就是在旋转盘共聚焦显微镜中针孔大小和间距的重要性。在传统的旋转圆盘中，正如我在上一张幻灯片中所说的，我们有聚焦的光穿过针孔，但由于间距或大小不合适，聚焦外的光也被捕获，所以没有办法深入样品而不失去共聚焦或捕获更多的背景光，因此，降低了我们获取的图像的信噪比。在新一代的旋转磁盘上，针孔的大小和间距已经得到了优化，因此实际上现代旋转磁盘可以成像比30微米深得多，没有针孔串扰的数百微米。

在这张幻灯片上，我想向你们展示在旋转盘共聚焦显微镜中针孔大小和间距的重要性。针孔间距就是针孔之间的空间，针孔直径显然就是针孔的直径。在这张图中，我向你们展示了背景光的排斥与10微米厚到80微米厚的样品厚度的比较。例如，对于黑线，我们有一个直径为50微米，间距为253微米的针孔，它可以拒绝10微米样本中的一些背景光，但超过一半的光，背景光，被捕获在图像中。在80微米的样品中，它不会排斥大量的背景光，这意味着这种间隔不允许它深入样品内部。对于100微米的针孔，580微米的间距，我们对背景光有更多的排斥无论是在10微米的样品中，还是在80微米的样品中。这将随着不同的设计而增加，例如，50微米的针孔和580微米的间距，或者40微米的针孔和定制的间距。事实上，即使在80微米的样本中，我们对背景光的排斥率也很高。

这些实际上是旋转圆盘共聚焦图像的例子。这是一个果蝇胚胎，我想在这里向你们展示的是实际上旋转的圆盘共聚焦图像可以让你获得非常快的图像这是在2个通道中获得的近300张图像，这是在77秒内获得的。这个图像是300微米的深度。所以我们实际上可以通过旋转成像细胞和组织的内部，用现代技术旋转圆盘。

另一个例子表明，我们可以用现代技术旋转圆盘成像细胞和组织的深处。这是一个被清除的组织，灌注着红色的珠子，在20倍的物镜中有8000个光学切片，只是为了展示，这是2.4毫米的深度。

这是旋转圆盘成像的另一个例子，在旋转圆盘共聚焦成像中获得的果蝇卵室，你可以在样本深处成像，就像我之前展示的那样。

此外，在我忘记提到之前，旋转磁盘在21世纪初被引入市场，因为它们实际上是一种快速实时成像的替代品，可以拒绝失焦光。旋转圆盘允许非常温和的成像和快速的成像以及长时间的成像，这是旋转圆盘在小鼠组织中的共聚焦成像的另一个例子并在肠道中分析血液流动的深度成像以每秒200帧的速度。

我一直在跟你们讲旋转圆盘和点扫描仪但是你应该根据你的具体应用选择哪种显微镜呢?

我想告诉你们的第一件事是你可以使用你的设备或实验室里的任何显微镜。您可以尝试优化特定显微镜的设置。这些其实是…我给你们展示的是一些指导方针，如果你有不止一个显微镜可以选择，也许这种或那种方法更好，但如果你没有，那就用你现有的显微镜试试。你可能需要调整和努力工作来获得数据，但我相信在许多情况下你可能会达到目标。对于一个固定的薄图像，宽视场总是一个很好的选择。又快又便宜，是个不错的选择。对于一个大的，多瓦成像，因为旋转磁盘也相当快，旋转磁盘是一个非常好的选择。对于较厚的样品，旋转圆盘和点扫描仪都比宽视场更合适。对于更厚的样品，一般来说，点扫描仪超过了旋转圆盘。 On a large, multi-tile image, the point scanner would also be useful but because if it's a very large image, it might take a longer time to acquire, then the spinning disk could be a better option because you save time. It's much faster to get your data. On the other hand, if you want to use spectral unmixing, if use fluorochromes in which the spectrums overlap then you'll definitely need a point scanner, but if you are using very low light imaging, the choice would come into a spinning disk because the detectors are much more sensitive.

然后考虑到时间分辨率的实时样本，现在我谈论的是一个完整的视场，获取视场…你能得到的最大视野。对于薄样本，宽场和旋转圆盘实际上是低时间分辨率或高时间分辨率的最佳选择。对于较厚的样本，通常我会选择旋转磁盘，但点扫描仪与低时间分辨率，也可能工作，如果你想…你想要的时间分辨率或者如果你想要。如果你需要更快，你可能还需要裁剪视场，因此，你也可以使用点扫描仪，尽管为了更快的采集，具有更厚样本的旋转磁盘是…这永远是最好的选择。

这是一个神经元细胞的例子，这是蜻蜓共聚焦显微镜中旋转圆盘的图像。

这是另一个旋转圆盘共聚焦显微镜成像的例子以每秒三帧的速度进行快速成像。

就这样，我结束了我的演讲。非常感谢大家来听我的演讲，我很乐意回答大家的问题。