全内反射荧光显微镜(TIRF)是一种具有数十年历史的基于相机的成像技术,它擅长观察和突出细胞标本的基面或界面,具有优异的轴向分辨率,比共聚焦显微镜提供的轴向分辨率高5-6倍。实现这种轴向分辨率所需的光学相当简单,因此,该技术已成为阐明基本生物过程的关键特征的工具,如囊泡运输和融合/排泄、脂质、蛋白质和细胞骨架膜相互作用、细胞粘附和病毒衣壳组装动力学等。近年来,TIRF已经成为先进技术的工具,如单分子成像和超分辨率显微镜。
在本显微镜课程讲座中,John Oreopoulos博士介绍了TIRF显微镜的基础知识,成功进行TIRF成像实验的必要条件,TIRF图像分析的挑战,并讨论了TIRF显微镜如何与其他成像模式相结合(同时或连续),促进了我们对复杂细胞过程和分子动力学的理解。本文还将回顾该技术的一些最新进展。
主要学习目标:
你好,我是John Oreopoulos。我是Andor科技公司的显微镜系统专家,今天我将向你们介绍全内反射荧光技术,或称TIRF显微镜。每当我介绍这个话题时,我总是喜欢从一张山的照片开始。通常情况下,天气条件和风的运动模式导致云雾覆盖山顶,掩盖了山底或山面本身的潜在细节。
当我们用广角epifluorescence显微镜观察细胞培养时,也会发生类似的情况。假设我们在培养皿中培养了一些细胞,我们用传统的荧光显微镜观察这些细胞。在这些类型的设置中,汞基或氙基光源被用于消除样品,我们最终有效地用穿过整个电池体积的光爆破所有的样品。
在这个图中用绿圈表示的细胞内的任何荧光物体都会发光并发出荧光,我们可以在通过适当的发射过滤器后看到。这里有一个现实生活中的例子。在这张显微照片中,我们看到的是单层上皮细胞,这些细胞被转染了荧光版本的蛋白网格蛋白,这种蛋白在内吞过程中起着关键作用。
在这幅图像的某些部分,我们可以看到微小的膜核内体吸收点作为小的,明亮的衍射限定点。但在许多地方,我们对这些斑点的观察受到细胞内细胞质蛋白失焦干草的阻碍,并且远离基面与显微镜封面的接触。这种细胞状的雾很像云,隐藏了山顶的细节,我刚刚在这个演示的第一张幻灯片中展示过。对核内体的不受阻碍的观察是相当不幸的,因为它阻止了我们观察这个多面的过程,这个过程实际上涉及许多蛋白质与网格蛋白相互作用。
其他生物物理方法如冷冻电子显微镜已经显示网格蛋白在核内体周围形成三骨架结构笼。但是这种笼状结构的动态性质和导致细胞膜被细胞吸收的一系列事件仍然知之甚少。许多研究人员正试图利用多色荧光显微镜,结合蛋白质基因修饰技术,梳理出网格蛋白介导的胞吞作用的动力学细节。但是,大视场外延照明产生的细胞雾使我们的工作变得困难。
耶鲁大学的Derek Toomre有句名言,很好地总结了另一种生物现象的问题。它是这样写的:“在生物学的整个分支学科中,只要人们能够以足够高的空间分辨率看到这一过程,就可以直接证明争论了几十年的这个过程的模型。“这解释了为什么人们花费了这么多年的研究,试图开发新的方法,使用各种光学切片技术来避免或消除失焦荧光模糊。
大多数人当然都熟悉共聚焦显微镜和反褶积显微镜,它们都能实现一定程度的光学切片。在这里,我将详细解释鲜为人知的第三种方法——TIRF显微镜是如何做到同样的事情的,但与其他两种技术相比有一些关键的区别。那么它是如何工作的呢?让我们从一块玻璃开始,然后从它的侧面看它。
我们大多数人都曾在中学或大学学习过物理入门课程。从这里,你可能会想起一个光学定律叫做斯涅尔定律。斯涅尔定律是一个简单的数学等式,它预测了光束接近1和离开2(两种不同光学介质之间的界面)的角度。这一等式取决于两种介质的所谓折射率。对于我们的玻璃板,相关的折射率约为1.51。对于玻璃实验室周围的空气,折射率为1。现在让我们想象一下,我们先让一束激光以垂直于界面的角度穿过界面。在这种情况下,我们看到激光束直接穿过,没有角度偏差。
如果我们以相对于界面法线的小角度让激光束穿过玻璃板,从而增加1,我们会看到少量的激光以相同的角度反射回玻璃板,而大部分激光束以更大的角度折射出玻璃板,这同样符合斯涅尔定律。随着激光束入射角的进一步增大,这种趋势将继续下去。这种趋势一直持续,直到达到一个特殊的角度,我们称之为临界角C,在这个角度下,玻璃-空气界面的入射光束以等于90度的角度(2)折射,掠过界面表面。注意,临界角可以计算出来,因为它只取决于两种光学介质的折射率之比。
然后如果玻璃板的入射角增加一点超过临界角,有趣的事情就会发生。而不是折射出玻璃,激光束现在完全反射回板。这种光学效应被称为全内反射,这一现象解释了为什么钻石如此明亮和闪闪发光。这可以通过观察传统钻石的侧面轮廓来理解。在这里,你可以很容易地看到为什么有角度的切割是如此重要,可以高度影响钻石的成本。理想切割的钻石具有双重的全内反射,使它显得非常明亮和耀眼。而切割过深或过浅的钻石则分别会显得颜色变深和浑浊。所以,当你的未婚夫去买订婚戒指的时候,一定要让他知道斯涅尔定律。
全内反射还解释了为什么光纤能够在很少甚至没有功率损耗的情况下传输长距离的光。但你们在高中或大学基础物理中学到的实际上是一个非常简化的几何光学观点,关于光在界面内部反射时会发生什么。在瞬时激光束击中界面并随后完全反射回高折射率光介质的接触点发生了什么?这个问题的答案可以在任何物理光学教科书中找到,比如赫克特的这本。
不详细说明,一个简单的解释是,大多数物理现象在边界处是连续的。也就是说,一个物理现象和一个界面不可能有不连续的变化。利用麦克斯韦的电磁学方程,有可能推导出一种特殊电场的存在,称为倏逝波或倏逝场,它的强度分布表现出指数衰减特性。
倏逝场的衰减常数称为穿透深度DP,它取决于光学介质的折射率、光束入射角和波长。使用典型值,穿透深度计算出来大约是所用光波长的五分之一。正如赫克特在他的教科书中所阐述的那样,倏逝波是电子量子隧穿介质界面的光子模拟物。
现在让我们考虑第二种光学介质是水的情况,它的折射率和2大约等于1.33。我们会在玻璃水界面注入一束48纳米的蓝色激光束入射角约为65度。在这种情况下,倏逝场的穿透深度约为100纳米。我们将在界面上方的水中放置一个绿色球体代表的小荧光物体。我们的荧光物体在扩散进入消失场之前不会发出可检测到的绿色荧光。
这意味着,确实有一些能量转移到水介质中,导致光吸收和随后的荧光发射。在这种情况下,“全内反射”中的“全”这个词有点用词不当。只有在第二种介质中有某种物质能够吸收光的情况下,能量转移过程才会发生。这个过程被称为受挫全反射。
实际上,下次你用手端着一杯外面有一点湿气的冷水时,你可以观察到这种非荧光的效果。透过水,你可以很清楚地看到构成指纹的皮肤图案、线条和曲线。那么这一切的应用是什么呢?让我们再一次从侧面考虑我们的玻璃板。
在20世纪80年代初,Dan Axelrod(现在是密歇根大学安娜堡分校的荣誉教授)有了一个聪明的主意:在一块玻璃上培养一些活细胞,让激光束以很大的斜角穿过玻璃,然后把整个装置放在显微镜下。Axelrod用亲脂性碳菁荧光探针DiI-C 16标记了这些细胞的细胞膜,使用瞬变照明并将显微镜通过标本聚焦到细胞的基面。阿克塞尔罗德随后能够获得与玻璃界面接触的细胞膜区域的超清晰图像。从本质上说,他之所以能够看到细胞的指纹图谱,是因为全内反射的阻碍。这就涉及到光学切片的概念,即通过更少的照明看到更多。
这是阿克塞尔罗德开创性研究的相关显微照片最初发表在《细胞生物学杂志》上。“在左边,我们看到了这种标本的规则广域epifluorescence图像,在右边,显示了样品的相应的TIRF图像。在广角外显荧光中,细胞在黑暗的背景下几乎没有对比度,但在TIR光照下,细胞的不均匀接触区域变得很明显。
这是我们的广角epifluorescence图像上皮细胞表达网格蛋白GFP。让我们用TIR照明来观察这个相同的视场。该样品对应的TIRF图像清晰地显示了细胞中每一个网格蛋白包被的核,没有任何细胞质蛋白失焦模糊或背景模糊。注意,现在每个细胞的细胞核阴影都是看不见的,这是另一个迹象,表明我们看到的是玻璃覆盖物上非常小而浅的细胞膜光学部分。事实上,在这张图像中,现在几乎不可能确定视野中每个细胞的细胞核在哪里。
由于TIRF显微镜是一种宽视场技术,图像是通过快速灵敏的摄像机探测器获得的,因此有可能获得这些活细胞的电影,以观察蛋白质的动态行为。这是前一张幻灯片中一个细胞的放大视图,显示了几分钟的采集加速了视频速率,以展示不同类型的蛋白质与膜的相互作用。
像这样的TIRF电影可以使用各种自动图像分析例程进行处理,这些例程可以量化蛋白质运动、强度变化,甚至是簇或斑大小分布。所有这些图像参数都可以用来制定有关被检测生物过程的统计数据。那么,阿克塞尔罗德用来获取细胞标本的TIRF图像的实验装置是什么样子的呢?他使用一系列光学机械部件来引导和聚焦一束自由空间发射的激光束,对准安装在倒置显微镜上的定制样品室。使用一个玻璃立方体,用一滴浸没油与腔盖接触,激光以陡峭的斜角耦合到样品基板界面。Axelrod称之为基于棱镜的TIRF设备配置。
这是一个基于棱镜的配置样品室的特写示意图。细胞倒置培养在玻璃盖上,封闭腔室,允许连续的液体交换。Axelrod的研究小组也展示了同样结构的直立显微镜版本。虽然基于棱镜的TIRF显微镜设计简单,成本低,但它也有一些缺点。
首先,对齐是棘手的,很难复制。试样必须安装在非常薄的腔室中,被照射的表面必须通过试样的整个体积成像,因此需要考虑光学像差。最后,这种配置使用开放的激光束路径。因此,人们对激光和眼睛安全的担忧比比皆是。那么问题来了,有没有另一种方法可以在相同的光照条件下不受早期TIRF显微镜设计的这些缺点的影响?这个问题的答案是肯定的。几年后,安德里亚·斯托特和丹·阿克塞尔罗德用一种巧妙的光学技巧和高数值孔径物镜提出了解决方案。
在左边,我们看到一个现代的高钠油浸物镜。这些镜头是非常昂贵的,因为在物镜筒内有大量的光学元件,由奇异的玻璃组成,当形状和使用在正确的组合导致高空间分辨率无像差的高信号水平的图像。通常情况下,这些光学元件仍然由熟练的技术人员打磨并组装到物镜筒中。右边展示的是在Zemax等光学射线追踪程序中使用透镜玻璃和形状处方组成的物镜内的玻璃元件的光学模型。Zemax允许人们看到光是如何通过物镜传播的。
在这里,我使用Zemax将一个扩展和准直激光束发射到一个高NA物镜的后孔径。在这种情况下,我们可以看到与激光束相关的单个射线如何最终在物镜的顶部形成一个紧密的焦点,然后从样本平面发散。这是激光进入单点激光扫描共聚焦显微镜物镜的条件
在继续进行光线追踪练习之前,我想提醒大家物镜,不仅在物镜的顶部有一个相关的前焦平面,而且在物镜的底部或附近也有一个相关的后焦平面。你可以用一个物镜对着一个遥远的目标物体,通过物镜的后端观察那个物体来证明这一点。当你这样做时,你会看到一个小的缩小和倒置的图像的目标在某个地方或接近物镜的后光圈。在这种情况下,你看到的是物镜后焦平面。
回到光线追踪模型,如果我现在在激光束的光路中插入另一个简单的透镜,这样光就会聚焦到物镜的后焦平面上,而不是物镜中出现的紧焦点,我现在就得到了一个细的紧准光束,直接指向物镜的顶部。如果我横向偏移简单聚焦透镜从光轴的位置,这样光束沿物镜后光圈横向径向移动,我们就会看到准直光束开始从物镜顶部以与光轴成一定角度的角度出现。
我可以继续增加镜头的横向偏移量,以进一步增加从物镜顶部出现的准直光束的角度。我可以一直这样做,直到达到一个点,出现的准直光束以相对于光轴的90度角离开物镜,并掠过玻璃盖套表面。只要在显微镜上建立一个类似的光学装置,在培养皿中注入少量荧光水溶液介质,就可以用肉眼观察到这种效果。最后,如果我把聚焦激光束平移到物镜光圈的边缘,稍微超出这个点一点,如你所料,所有的准直激光完全在内部反射到顶部的玻璃水界面上。所有这些都是为了证明激光束在后焦平面的径向位置与在前焦平面的入射角之间存在关系。聚焦激光束径向位置越长,照射角度越倾斜,穿透深度越浅。
再次透过物镜的背面,我们可以看到,只有当激光束聚焦在一个非常薄的环形区域时,才会发生全反射,这个环形区域用物镜背面焦平面的红色表示。现在让我们仔细看看在物镜的前焦平面发生了什么。让我们再想象一下,我们有一层单层的荧光细胞生长在玻璃封面上。在这个物镜模型的放大视图中,我们可以看到,经过准直的激光束以一个明确的入射角接近物镜的前焦点并内部反射。看,我们已经达到了使用高数值孔径物镜进行全内反射照明的条件任何由样品产生的荧光在物镜数值孔径锥内被捕获通过适当的发射滤波器后被定向到相机。
实现这种照明方案的实验仪器被称为透物镜TIRF显微镜配置,实际上许多商用TIRF显微镜使用这种方案而不是基于棱镜的设计,因为它简单,能够同时从样品中收集尽可能多的荧光。通常,激光通过带有横向偏移的调节机制的epifluorescence显微镜的背口进入,发射光被定向到安装在其中一个显微镜成像端口上的摄像机。
让我们再花点时间考虑一下,物镜的后焦平面区域允许发生TIR照明。这张图显示了后焦平面中可用的TIR照明的环形区域,红色部分,随其数值、孔径和放大倍率的变化而变化。左边的透镜有一个非常小的环形区域可供TIRF使用,在这种情况下很难对光束进行正确的聚焦和校准。然而,中间的镜头和左边的是一样的,只是数值孔径更高。注意这个镜头的后焦平面阴影区域的厚度大约是左边阴影区域的两倍。
然后在右边,我们可以看到保持数值孔径不变,并将放大倍率从60倍增加到100倍,其效果是,再次缩小环形区域,在那里可以实现TIRF照明。中间的物镜比左边的物镜能达到更小的穿透深度。但右边的物镜可以达到与中间物镜相同的最小穿透深度,尽管激光对准必须更精确,因为阴影环形区域更小。
这张幻灯片上的环形区域的厚度假设样品的折射率等于水的折射率。但实际上,根据试样的特性,试样的折射率可能略高,从而使这些环形环的厚度减小。需要注意的是,存在更大的数值孔径TIRF物镜,可以增加后焦平面环形区域的厚度。这些物镜允许用户访问更浅的穿透深度,导致玻璃水界面的光学部分更薄。例如,数值孔径为1.65的100X物镜是可用的。然而,也应该注意的是,像这样的物镜需要挥发性和有毒的浸泡油,可能具有腐蚀性。而且书套价格昂贵,因为书套必须由蓝宝石制成,蓝宝石的折射率为1.78。
TIRF显微镜可以补充其他成像技术。Andor蜻蜓独特地结合了宽视场epifluorescence,高速3D共聚焦成像和TIRF显微镜到一个单一的仪器平台,连接到任何研究级显微镜。幻灯片右侧的顶部使用示意图显示了这三种不同照明方法的光路以及它们是如何合并并注入到显微镜侧孔的。三种成像模式的荧光发射路径是共同的,并且它们共用同一个相机,这意味着我们也可以自动配准这三种成像模式的图像。由于这三种成像方式的图像是在蜻蜓平台上相互注册的,所以我们可以直接比较不同照明技术的光学切片能力
这里,我们可以再次看到表达荧光网格蛋白的细胞。中间标本的共焦图像在排斥失焦光方面明显做得更好,而在左边的表观荧光图像中可以看到,但右边的TIRF图像表现出了比共焦图像更好的对比度和失焦模糊回避。下面是另一个演示相同内容的例子。这一次,我们观察的是表达荧光版本的局部粘附蛋白zyxin的细胞。细胞的核阴影在细胞的外荧光和共聚焦图像中都可见,但在TIRF图像中不可见。TIRF图像真实地显示了细胞接触玻璃覆盖物的足迹区域,并且更容易识别聚集zyxin蛋白的小而明亮的粘附点。
这是你需要记住的重要一点,TIRF显微镜最大的优点也是它最大的缺点。这真的是一把双刃剑。在当今各种超分辨率的光学显微镜技术中,TIRF很容易达到最高的轴向分辨率之一,但TIRF成像仅限于样品衬底界面。用共聚焦显微镜对样品进行三维光学切片是完全不可能的。
这个表直接对比了TIRF显微镜和共聚焦显微镜的一些特性。两种技术的横向分辨率大致相同,但请再次注意,当在玻璃-水界面成像样品时,TIRF的轴向分辨率比共聚焦显微镜大约好一个数量级。与共聚焦显微镜相比,TIRF显微镜的另一大优势是探测器的灵敏度,非常快的成像速度,以及通常较低的成本。
现在,我想重点谈谈TIRF显微镜的一些具体应用。万博电脑网页版登录下面是TIRF擅长观察的主要细胞过程和结构的列表。这包括分泌颗粒和囊泡跟踪,胞吞和胞出,细胞外基质结构和组装,查看脂质和膜蛋白生物物理学,单分子蛋白运动和动力学,细胞粘附,迁移,运动和力学,甚至膜运输动力学。我们可以观察钙火花和离子通道,膜和细胞骨架重塑,表面或界面化学,信号转导,病毒组装和动力学,甚至超分辨率成像。
让我们看看过去科学文献中的一些例子,以及一些现代案例研究。这是Kai Simmons研究小组在2000年发表的一个非常早期的例子。在本研究中,TIRF被用来监测从高尔基体到细胞膜的囊泡运输。为此,研究人员用两种不同颜色的荧光探针对高尔基体和囊泡进行了双重标记。其中一个探针是用广角epifluorescence成像的,这当然可以让他们一次看到整个细胞体积。然后在TIFR通道中观察另一个探针,这允许他们只观察细胞膜。
在这两种成像模式之间的快速切换被证明是跟踪囊泡运动的有效方法,从细胞体积的上部,向下到细胞膜,直到囊泡融合点。在这项早期研究中获得的活细胞的影像确实非常令人震惊,它们揭示了整个细胞中高速公路般的运输囊泡。但这项研究中捕捉到的最有趣的时刻是囊泡与细胞膜融合的时刻。这是细胞的放大视图。每一个明亮的绿色闪光代表一个单一的囊泡融合事件。研究人员注意到,靠近细胞膜的囊泡的运动可以分为三种类型之一,包括融合的囊泡,靠近细胞膜的囊泡,然后在没有融合的情况下接受备份进入细胞,还有保持静止的囊泡,在最终融合之前在膜附近徘徊了一段很长的时间。
这是最早对大量此类事件进行分类和分析的研究之一。这使得研究人员能够开发出所谓的囊泡动力学的接吻和奔跑模型。这张来自论文的图显示了研究人员如何使用兴趣区域图像分析方法来建立不同囊泡行为的统计数据。1995年,Funatsu和他的同事在《自然》杂志上发表了另一项开创性的早期研究。这是首次证明单荧光分子的视频速率室温成像的研究,并通过严格的样品制备技术与TIRF显微镜的使用相结合,在增强CCD相机上实现超低背景信号水平成为可能。
研究人员可以确定,通过跟踪相机背景噪声水平的逐级光漂白光斑强度行为,他们正在观察并限制他们的分析仅针对单个分子。这篇论文的一个令人惊讶的结果是,研究人员能够通过图像分析,利用观察到的分子翻转事件寿命的线性回归,确定与覆盖衬底结合的单个肌凝蛋白分子的ATP能量分子解离率。
这是一个最近的例子,TIRF显微镜被用来更好地了解活细胞内的病毒组装。这项2008年发表在《自然》杂志上的研究利用TIRF的敏感成像特性来跟踪单个HIV病毒粒子在细胞膜表面的动态形成。对单个病毒组装事件的统计强度分析再次允许确定三种不同类型的病毒粒子组装途径,这是传统生物化学方法无法实现的。
分子马达是重要的细胞机器,促进囊泡在细胞内的运输。多年来,结构生物学的研究和方法做了艰苦的工作,以了解这些马达是如何与细胞骨架微管结合的。但缺乏输运的动力机制。在这项研究中,Ahmet Yildiz和Paul Selvin开发了一种技术,使用TIRF显微镜跟踪和定位单个mysoin分子马达的位置,使用亚像素定位的概念,精度非常高,可达一纳米。
这种精确度使研究人员能够确定两种潜在的肌凝蛋白运动模式中哪一种确实存在于自然界,是手把手式走路还是尺蠖式走路,每一种都有不同的可预测步长,范围在几十纳米之间。单分子TIRF成像实验结合定位分析,使他们得出第一种运动模型,即倒手行走运动是正确的运动机制。正因为如此,我们现在有了非常精确的囊泡运输过程的分子模型,对各种肌肉退行性疾病的影响也更清晰了。
有时细胞成像研究需要TIRF的快速灵敏度和共聚焦的3D成像能力。德永和他的同事在2008年出版的《自然方法》杂志中指出,通过调整TIRF的照明角度,使其达到或略高于临界角,可以在成像质量上做出妥协。这导致高度倾斜和叠层斜光束通过样品的方式类似于光片显微镜。
这种成像策略,简称为HILO成像,对于发生在细胞内部和细胞膜外的单分子研究非常有效。事实证明,TIRF和HILO成像对于所谓的基于定位的超分辨率显微镜方法也是非常有用的,这种方法利用了与分子马达相同的亚像素定位策略。DNA涂料就是这样一种超分辨率技术,它使用TIRF或HILO成像,利用与互补单链DNA序列相连的荧光团的开关闪烁行为。在溶液中,这些DNA探针分子短暂地与二抗结合,二抗体与探针分子匹配,并附着在感兴趣的细胞结构上。快速获取以这种方式标记的样本的成千上万张TIRF或HILO图像,然后定位每个荧光开关事件的亚像素位置,这样就可以组成样本的超分辨率图像。
这是另一种细胞黏附复合物蛋白,塔林的超分辨率渲染图,由我们位于特拉华大学的Andor蜻蜓客户制作。这是同一单元的特写视图显示了样品的常规衍射受限TIRF成像和相同视场的超分辨率渲染之间的比较。图像分辨率的提高使研究人员能够探测和询问与这种蛋白质相关的分子机制以及它在粘附复合体中与之相互作用的其他蛋白质的更深层次的问题。
最后,让我用一些实用的提示来结束这次演示,这些提示是给想要尝试和使用TIRF成像技术的人的。首先,在真正的TIRF条件下,我的意思是,当激光束被设置为一个超临界消光角时,你应该只能聚焦在样本内的一个平面上,盖滑移玻璃水界面。TIRF使用相干激光光源,因此干涉条纹难以消除。尽可能保持所有光学表面的无尘是很重要的,特别是任何显微镜自动聚焦的二色差,并在必要时清洁它们。
最后,您可以随时检查光学对准使用荧光珠或高光或浸没在水中的模具。这里的图像显示,一碟荧光水允许人们确定激光束是否聚焦到物镜后焦平面,并确定激光束是否处于亚临界或超临界入射角。
这是你在成像荧光珠溶液时应该看到的。当入射角设置为照明的亚临界角时,视野中应该充满快速扩散的荧光珠,并进入和离开焦点。相反,当入射角设置超过临界角时,你应该只观察到荧光珠粘附在玻璃盖上,图像背景应该变得非常低。非粘附荧光珠扩散到消失场应该出现闪烁或快速闪光,因为他们移动上下。
在这里我留给你们一些与TRIF显微镜相关的参考资料。丹·阿克塞尔罗德的所有评论论文都应该被视为必读材料。帕克在“酶学的方法”一章中提供了一些非常实用的建议,帮助你学习使用光学机械原型零件,甚至建立你自己的TIRF显微镜。
为了获得关于这种成像技术最新发展的最新信息,我推荐这张幻灯片底部列出的三位研究人员发表的作品。所以我们在演示开始的时候用了这样一张图,注意到云是如何使我们看到山的。我说过,这些云就像细胞雾或失焦模糊,在使用表观荧光显微镜时阻碍了我们对细胞的观察。TIRF避免了这种雾的产生,把云掀走,让我们看到位于山脚下的细微细节。说到这里,我想感谢你们今天的到来。