基于拉曼光谱的细胞无标记鉴定

对于生物制剂的开发，转基因细胞系经常被用于有效地生产治疗性蛋白质。高产量细胞克隆的确定和这种细胞系的放大是一个非常耗时和昂贵的过程。高效生产单细胞的自动化识别和选择可以显著加速这一过程。

OptisCell流程旨在将识别细胞系所需的时间从12个月减少到3个月。拉曼光谱用于蛋白质生产细胞的无标记功能鉴定。然后，用激光单细胞转移过程分离这些细胞。这减少了增殖率不足的细胞克隆的扩增和培养步骤的数量。因此，可以比传统工艺更早地选择适合生物技术生产的候选细胞。OptisCell的自动化流程链还可以筛选大量的候选产品，并准确跟踪流程，以便后期进行质量控制。

在opticell过程的第一步中，使用HoloSpec拉曼光谱仪分析细胞池中的单细胞产生特定蛋白质的情况。该系统使用机器学习算法来区分生产细胞和非生产细胞的拉曼光谱。在第二步，高生产者细胞转移到微量滴定板使用激光脉冲。

该过程被称为激光诱导前向转移(LIFT)，其中载体上的吸收层被激光脉冲汽化。小气泡在介质(例如水凝胶)中产生射流，从而将所选细胞转移到微量滴度板上。该过程链允许快速和自动识别高产细胞，并从细胞池中选择它们进行进一步培养。opticell工艺室的图片如图1所示。

图1:拉曼光谱和LIFT工艺的工艺室。以微量滴度板为接收器，玻璃盖片为传递载体。

方法

作为自动化高产生细胞识别的初步测试，现有由Fraunhofer IGB提供的产生干扰素β CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO dhlr‐INFβ)的拉曼光谱，并使用Fraunhofer FIT的机器学习软件进行分析。来自潜在高产生电位细胞的拉曼光谱首先要经过预处理，以消除光谱中的干扰信号，如宇宙峰值、白噪声和进一步的背景信号。

然后，用主成分分析(PCA)降低特征维数，并使用四个独立的加权模型来确定哪些光谱包含高产生细胞。

为了验证opticell机器内置拉曼光谱仪的能力，分析了直径为8 μm的荧光微球(Dragon Green荧光聚合物微球FSDG007, Bangs Laboratories, Inc.)。

首先，通过刀片在玻璃盖载玻片上涂上50μm厚的明胶层(5%的明胶来自牛皮，G9391, Sigma Aldrich)制备转移载体，并在水凝胶层顶部应用荧光微球。为了让微球沉淀，将悬浮液留在转移载体上4分钟。然后去除多余的悬浮液，将转移滑块放置在OptisCell机器中。使用10倍物镜(MSPlan 10, NA 0.3, Olympus)扫描转移载玻片并定位孤立的荧光微球进行拉曼分析。拉曼光谱使用785 nm激光源(iBeam smart 785‐S‐WS, Toptica)， 50倍物镜(50x MPlanFL N, NA 0.8, Olympus)和HoloSpec光谱仪(HoloSpec f/1.8i - NIR, LOT withiDus 416CCD, Andor)在共聚焦拉曼装置。记录后的拉曼光谱进行预处理，将光谱归一化并减去背景信号。

图2:通过OptisCell系统的拉曼光学拍摄的荧光微球照片。

结果

我们能够用OptisCell系统精确地瞄准单个微球，并用HoloSpec拉曼光谱仪测量它们。图3显示了一个示例光谱。荧光微球的聚苯乙烯的特征峰可以清楚地识别，而不需要高水平的信号处理。利用预记录的潜在高产者拉曼光谱自动检测蛋白质生产细胞，其准确性可达92%，可将细胞识别为真正高产者。示例结果如图4所示。在那里，机器学习软件正确地识别了26个细胞光谱池中单个蛋白质生产细胞的光谱。

图3:单个荧光微球的拉曼光谱显示微球中聚苯乙烯的特征峰

结论

OptisCell系统是一种用于生产蛋白质细胞系的时间和成本效率开发的机器。我们已经证明了OptisCell‐System的内置拉曼光谱仪能够分析具有足够拉曼强度的小物体。此外，通过拉曼光谱自动检测蛋白质生产细胞的准确性可达92%，其中细胞被认为是真正的高产细胞。

在进一步的研究中，蛋白质生产细胞的自动检测将被实现到OptisCell‐System中，从而在一台机器中实现整个过程。

图4:25个低生产者或无生产者细胞(蓝色)和一个高生产者细胞(红色)的拉曼光谱。在右上角，描述了PCA的降维特征空间。