克服成像动态过程中的挑战

挑战的背景

线粒体为细胞提供能量，因此是真核细胞必不可少的细胞器。线粒体动力学缺陷与神经退行性疾病、心血管疾病和神经代谢性疾病等急性综合征相关。

线粒体的显微镜检查要求很高，这些细胞器有一个复杂的内部结构，有两个膜，一个光滑的外膜和一个极其曲折的内膜。除了膜结构外，线粒体很小，大小接近光学显微镜的分辨率极限。此外，线粒体是极具活力的细胞器，可以分裂、融合、改变形状并沿着细胞内空间移动。所有这些特征都为研究活线粒体的动态行为(裂变和融合)以及导致融合或裂变的潜在快速信号传递过程成像带来了障碍。

当成像活线粒体时，除了实时成像的关键挑战，包括光毒性、光漂白，其他问题需要克服。图像必须具有高的时间和空间分辨率。事实上，要获得最全面的线粒体时空动态图像，需要获取4维(3D +时间)的图像数据。即使是固定的线粒体，由于其大小和复杂性，高空间分辨率也是必不可少的要求。

技术解决方案

基于相机的共聚焦系统是活线粒体成像的更好解决方案，不会因光毒性而影响细胞活力。该设备将需要在高速和高成像分辨率下采集。

• 速度——线粒体动态和钙信号的可视化需要一种可以同时获取多个通道的仪器，由于事件的快速性质，显微镜将需要以非常快的速度获取。
• 分辨率:观察线粒体运输所需的分辨率在XY中50-100纳米的窗口内。光学显微镜的衍射极限在200 nm左右;因此，有必要使用克服衍射极限的技术，即超分辨率技术。
• 活细胞超分辨率——超分辨率技术超出了光学显微镜的衍射极限，通常需要获取大量的帧(大约10帧)^3.到10⁴图像)和/或高光强度成像。在大多数情况下，样品制备是复杂的，也有特定的荧光团的要求。所有这些要求使得目前大多数可用的超分辨率技术与活细胞成像不兼容。

图1 -用Mito Tracker染色的活细胞在宽视野、共聚焦和共聚焦+ SRRF流中的图像。在宽视场、共焦和共焦SRRF流图像之间可以观察到分辨率的增加。使用带有srrf流的蜻蜓，科学家可以获得线粒体的活细胞超分辨率图像。

线粒体成像的Andor解决方案

由于蜻蜓的速度、灵敏度和分辨率，它是实时线粒体成像的完整解决方案。高灵敏度相机允许检测非常微弱的信号与高量子效率。蜻蜓和安铎的相机，如背光Sona或iXon EMCCD系列，可以实现超快的微光成像。像共聚焦旋转盘、dSTORM超分辨率(分辨率~ 20 nm)等成像模式都可以通过蜻蜓实现，这些成像模式对线粒体的研究都有优势。

重要的是，任何模态都可以与超分辨率技术SRRF(超分辨率径向波动)相结合。srrf流与活细胞成像兼容，提供了高速超分辨活细胞成像的优势。