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挑战的背景
线粒体为细胞提供能量,因此是真核细胞必不可少的细胞器。线粒体动力学缺陷与神经退行性疾病、心血管疾病和神经代谢性疾病等急性综合征相关。
线粒体的显微镜检查要求很高,这些细胞器有一个复杂的内部结构,有两个膜,一个光滑的外膜和一个极其曲折的内膜。除了膜结构外,线粒体很小,大小接近光学显微镜的分辨率极限。此外,线粒体是极具活力的细胞器,可以分裂、融合、改变形状并沿着细胞内空间移动。所有这些特征都为研究活线粒体的动态行为(裂变和融合)以及导致融合或裂变的潜在快速信号传递过程成像带来了障碍。
当成像活线粒体时,除了实时成像的关键挑战,包括光毒性、光漂白,其他问题需要克服。图像必须具有高的时间和空间分辨率。事实上,要获得最全面的线粒体时空动态图像,需要获取4维(3D +时间)的图像数据。即使是固定的线粒体,由于其大小和复杂性,高空间分辨率也是必不可少的要求。
技术解决方案
基于相机的共聚焦系统是活线粒体成像的更好解决方案,不会因光毒性而影响细胞活力。该设备将需要在高速和高成像分辨率下采集。
图1 -用Mito Tracker染色的活细胞在宽视野、共聚焦和共聚焦+ SRRF流中的图像。在宽视场、共焦和共焦SRRF流图像之间可以观察到分辨率的增加。使用带有srrf流的蜻蜓,科学家可以获得线粒体的活细胞超分辨率图像。
线粒体成像的Andor解决方案
由于蜻蜓的速度、灵敏度和分辨率,它是实时线粒体成像的完整解决方案。高灵敏度相机允许检测非常微弱的信号与高量子效率。蜻蜓和安铎的相机,如背光Sona或iXon EMCCD系列,可以实现超快的微光成像。像共聚焦旋转盘、dSTORM超分辨率(分辨率~ 20 nm)等成像模式都可以通过蜻蜓实现,这些成像模式对线粒体的研究都有优势。
重要的是,任何模态都可以与超分辨率技术SRRF(超分辨率径向波动)相结合。srrf流与活细胞成像兼容,提供了高速超分辨活细胞成像的优势。
关键需求 | 线粒体成像解决方案:蜻蜓和Andor的高量化相机 |
超高速采集速度 | 蜻蜓的EMCCD和sCMOS探测器允许非常低的光成像和高的采集速度。蜻蜓比点扫描共聚焦系统至少快十倍。内部光束分离器允许蜻蜓同时获得两个独立探测器(相机)上的两个通道。结果1-检测超快事件与采集速度高达400帧每秒。结果2-在不影响速度或分辨率的情况下,同时检测两个独立通道。 |
获取分辨率为50-100纳米的图像 | 支持dSTORM蜻蜓。蜻蜓也有一个机动散光透镜,创造一个校准的单分子PSF的非对称畸变,它随轴向离焦而变化。结果1-分辨率下降到20nm的dSTORM。结果2-结合dSTORM和散光镜头获得3D超分辨率图像。 |
获取实时超分辨率图像(分辨率高达100纳米) | Andor的相机提供了SRRF(超分辨率径向波动)的综合许可证。SRRF利用荧光团发射的波动及其插值来提高光学系统的有效分辨率。Andor的内置SRRF流算法允许实时SRRF计算和即时可视化的分辨率增加。此外,SRRF与传统的荧光团兼容,不需要复杂的样品制备。SRRF与共焦、TIRF和宽视场成像兼容,并与深度成像兼容。结果1srrf流最终数据的分辨率提高了2- 6倍(50- 150nm最终分辨率)。结果2-由于其低功率要求(mW/cm2W /厘米2range), SRRFstream兼容活细胞成像。结果3- SRRFstream算法允许在每秒10帧的帧率下获取突破衍射极限的活细胞图像。 |