微管激光消融

细胞的组织对其功能至关重要，了解组织如何影响功能是细胞生物学的主要目标。华盛顿大学圣路易斯分校的John A. Cooper博士和纽约奥尔巴尼沃兹沃斯中心的Alexey Khodjakov博士领导的研究人员使用微管消融技术来了解更多关于细胞如何利用细胞骨架将空间信息整合到细胞周期调节中。

出芽酵母细胞是一种用于研究细胞分裂的模式生物。在出芽酵母(酿酒酵母)的分裂过程中，有丝分裂纺锤体的一端穿过芽颈，将基因组传递给子细胞。纺锤极体突出的细胞质微管通过与细胞皮层相互作用，使纺锤体沿母芽轴定向，然后将纺锤极体穿过颈部进入芽内，从而完成这一过程。

细胞有质量控制机制，以防这个过程出错。例如，突变会导致纺锤体运动的延迟。在这种情况下，有丝分裂在母细胞中进行，但如果事情没有在后期自我纠正，一种称为纺锤体位置检查点的细胞周期检查点机制将停止有丝分裂。科学家们对这个检查点是如何阻止有丝分裂有一定的了解，但还不完全清楚检查点机制是如何检测到纺锤体不在正确的位置继续进行的。

先前的研究表明，当有丝分裂纺锤体没有充分地位于新生母细胞和子细胞之间时，分裂酵母会阻止细胞周期的进展。这意味着细胞必须监控纺锤体的位置，并解释它相对于其他一些位置，如地标。为了验证从纺锤体延伸到芽颈的细胞质微管对这一过程很重要的假设，Cooper的团队使用激光消融中断了微管与芽颈的相互作用。

图1-6:消融的不同阶段。

研究人员使用MicroPoint脉冲激光系统，将其发射调至539 nm，对动力蛋白突变芽殖酵母细胞中的GFPlabeled微管进行激光显微手术。动力蛋白突变体不能将纺锤体拉过芽颈，因此纺锤体位置检查点阻止了有丝分裂。

他们最初购买MicroPoint系统是为了给他们的显微镜添加光漂白/光激活模块，但该系统激光的可调性使他们可以灵活地使用该系统在实验中烧蚀微管。MicroPoint允许用户在激光消融过程中对标本进行成像，这使得研究人员可以直观地瞄准动态微管进行消融。微管在细胞中快速移动，因此能够在消融过程中观察细胞对于灵活定位和随后验证微管切断至关重要。

在使用539纳米光脉冲切断芽颈和纺锤极体之间的单个细胞质微管后，研究人员观察到剩余微管的远端片段发生了位移。片段和剩余的微管被解聚，几分钟后又生长回来。他们

监测这些细胞的纺锤体长达90分钟，以观察细胞是否在后期仍然处于停滞状态。为了成像，他们使用100倍，1.35 N.A.油物镜的倒置荧光显微镜，488 nm激光激发的CSU自旋盘共聚焦扫描仪和EMCCD摄像机进行检测，对细胞进行时间间隔Z系列拍摄。Z系列覆盖深度为3 um，间隔30或60 s进行捕获。

当芽颈部的细胞质微管被切除后，大部分细胞进行有丝分裂，这表明芽颈部的细胞质微管缺失激活了有丝分裂退出网络。接下来，研究人员进行了实验，以确定破坏不在颈部的细胞质微管是否会破坏检查点。在检查点激活的细胞中，微管从一个纺锤极体穿过颈部延伸，它们消融了另一个纺锤极体的微管(微管没有穿过颈部)。大多数细胞仍处于有丝分裂状态。最后，他们进行了破坏纺锤杆体或切断纺锤杆体附近微管的实验。这两种行为都没有促使有丝分裂退出。

总的来说，这些消融实验表明，破坏从纺锤体延伸到芽颈的微管导致细胞不能阻止细胞周期进程，从而退出有丝分裂。这表明细胞质微管对于读取细胞周期调控的纺锤体上游的位置很重要。这些发现对不同物种都有影响。在后生动物发育和成体组织内稳态的不对称细胞分裂过程中，它们对于基因组在细胞质适当区域的忠实分布可能特别重要。

设备清单

• CSU激光双自旋盘共焦扫描仪，配备EMCCD探测器
• 延时成像软件
• MicroPoint与539 nm染料谐振腔细胞
• 脉冲消融瞄准软件