离子信号显微术

细胞内离子的研究技术在生物学中被广泛应用，例如，识别活细胞内钙水平的空间变化，测量细胞内离子的浓度，包括细胞pH值，并监测这些浓度如何随时间变化。监测细胞内离子的变化对我们理解细胞系统中的信号和功能通路至关重要，对许多基本过程如肌肉收缩和突触神经信号传递至关重要。这种测量一直是包括药物发现研究在内的一系列研究项目的核心。钙通道是一类重要的细胞膜分子离子通道的代表。随着这些通道的打开或关闭，例如响应细胞外信使分子，细胞内离子浓度也会发生变化，从而改变细胞的行为。直接作用于这些离子通道的治疗剂可以为许多疾病提供有效的治疗。例如，针对钙通道的药物在治疗各种心血管疾病时很有用。荧光染料被设计成对特定离子具有亲和力;例如，FURA-2是钙离子特有的。当它们与离子结合时，它们的吸收或荧光性质就会改变。离子浓度测定的原理是，当自由离子浓度发生变化时，自由指示染料与离子结合染料之间的平衡也会发生变化，从而导致指示染料的光物理性质发生变化。Ratiometric microscopy is one approach for such measurements - by quantitatively interpreting the changes in fluorescent properties by looking at both bound and unbound dye ratio, the concentration of the ion being investigated can be measured. However, there are some common non-ratiometric dyes also, such as Fluo-4.

选用的荧光图像，用Revolution 488从1500帧动力学系列以30帧/秒的速度拍摄，显示Ca2+波的进展，因为它通过兔子尿道肌细胞。从细胞内偏移的roi中获得的动力学图显示Ca2+通量的时间进展。使用相同的视场，没有分箱，帧率被推到120fps，以获得更好的事件时间分辨率。由Mark Hollywood博士提供，邓多克理工学院平滑肌研究中心。

在许多组织类型中，离子通量变化发生迅速，非常经常在低毫秒的时间域。因此，离子结合荧光染料往往具有快速响应，使得自由离子浓度的变化能够以高时间分辨率成像，这就需要一种快速定量成像这些荧光强度变化的方法。然而，最终，我们实际上受到这些染料的结合常数的限制——无论离子浓度变化有多快，成像速率不需要超过染料扩散、结合和对自由离子做出反应所花费的时间。一种是更好地确定染料的结合常数，并使用适合于此的曝光时间。使用太短的曝光时间会对信噪比产生不利影响，这是最终的限制检测现象(会使你的图像看起来颗粒状和无法解决)，即使在“完美”光子探测器(100%量子效率(QE) +零噪声底)的情况下也是如此。另一个必须考虑的因素是所用离子染料的浓度。理想情况下，使用最低浓度的染料作为自由离子浓度的指标，这样，与所讨论的离子种类的总量相比，染料与可忽略不计的离子结合，因此它不会显著改变束缚离子和自由离子的统计平衡。补救办法是尽可能降低浓度，同时保持足够的曝光时间(因此帧率)所需的信噪比。

离子信号显微镜的Andor溶液

无论是作为Revolution共聚焦活细胞成像系统的关键组件，还是作为“独立”EMCCD + iQ成像软件解决方案，都是离子浓度超灵敏快速成像的成熟解决方案。在快速帧速率下实现的信噪比(S/N)非常适合于常见离子结合染料(如钙特异性Fluo-4)的细胞内可视化和测量。EMCCD技术可以完全消除读出噪声，即使在非常快的读出速率下，也非常适合钙瞬态过程的时间要求，如钙火花或波。像素格式为512 x 512的iXon Ultra 897能够使用128 x 128的ROI和“裁剪模式”功能实现595帧/秒。此外，iXon3 860背光照明能够> 500帧/秒@ 128 x 128像素格式。通过使用emccd，钙染料浓度也降低了，例如，钙波可以沿着拉长的平滑肌细胞的整个长度传播。高灵敏度也使励磁功率衰减。通过最小化激发功率，无论是激光还是基于灯，染料的光漂白速率可以显著降低。在活细胞环境中，这些“温和”的激发条件也减少了光毒效应，否则会杀死活细胞，使它们能够在更长的时间内被研究。

最近，随着sCMOS技术的引入，研究人员发现大视场、快速度和低噪声对他们的离子成像实验有好处。Andor有多种sCMOS探测器可供选择，以适应广泛的离子信号应用。万博电脑网页版登录Andor的Neo和Zyla 5.5有一个550万像素的传感器，带有“True Global Shutter”模式，如果你想在一张图像中同时拍摄多个信号事件，就需要使用这种模式。另外，Zyla 4.2有一个420万像素的传感器，具有更高的QE，提供了更高的测量离子浓度的灵敏度。安多的所有sCMOS相机同时提供大视场(5.5 MP或4.2 MP)，极低的噪声(< 1 e-)，宽动态范围(33000:1)和非常快的帧率(100 fps持续)。