胚胎发育的基本原理被实时揭示

光片显微镜，如SPIM(选择性平面照明显微镜)已被证明是一种有价值的技术，在常规显微镜(如共聚焦显微镜)太大的样品中表现得特别好。SPIM产生了多种变体、波束轮廓和配置。简单来说，对于SPIM来说，光学切片是通过用一片光照射样品并在薄片上产生荧光来实现的，然后用快速和高分辨率的sCMOS相机成像。这可以有效地控制试样的高信噪比照明。SPIM和利用sCMOS相机的一个方面是，这些技术产生的数据大约比共聚焦显微镜多三个数量级，因此这可能是数据传输、存储和管理的主要负担。

在这篇文章中，我们看看Jan Huisken和他的研究团队(MPI, Dresden)如何利用SPIM的光片显微镜方法和sCMOS相机的快速采集速度来研究斑马鱼发育早期阶段的内皮层。他们的研究重点是在斑马鱼发育的早期阶段，细胞在空间和时间上的协调，使内皮形成模式。早期内胚层的迁移对于器官的形成是非常重要的，因为原肠形成过程中细胞运动的缺陷会导致器官的复制或错误定位。Huisken和他的团队利用数据压缩和“动态”处理使这项技术取得了成功。

多视图实时成像SPIM配置

Huisken和他的团队构建了一个四镜头的SPIM系统(图1)，该系统集成了实时图像处理，可以高速传输多个视图，并针对捕捉整个斑马鱼内皮层进行了优化。他们装置的中心单元由四个相同的物镜组成。两个探测透镜及其相关光学器件将公共焦平面成像到两个sCMOS摄像机上。线性工作台沿检测轴通过焦平面移动样品，触发相机每两微米的采集。两个照明透镜在扫描过程中的每个位置交替用激光照亮焦平面。相机以62.5 fps的速度捕获整个视野~1.2 mm的图像。

图1。四镜头SPIM设置和图像采集。

斑马鱼胚胎(受精后5小时)被埋入含氟乙丙烯(FEP)管中1.5%低熔点琼脂糖中。为了使内胚层可视化，使用转基因斑马鱼品系Tg(sox17:EGFP)。该管安装在平台上，从顶部浸入充满介质的成像室。当样品在光片中移动时，摄像机获得了胚胎的良好分辨部分。这个过程花费了< 10s。Huisken发现，通过在每个时间点旋转胚胎45度来获得第二个互补视图，可以提高图像的质量。

数据管理

在实时采集过程中计算整个内胚层的高分辨率图像。在他们的方法中，一个典型的数据集需要千兆字节而不是千兆字节，并提供了显微镜下整个胚胎环境下细胞迁移的可视化和评估。从制图学中获得见解，他们能够生成2D地图投影，将整个胚胎可视化在一张图像中(图2)。此外，实时图像配准消除了胚胎在绒毛膜中的任何运动，并将所有胚胎注册到一个公共的预定义坐标系中。

图2。Tg(Sox17:EGFP)胚胎在3D和最终地图投影上的空间方向。

本案例研究基于Jan Huisken和他的团队发表的文章，可以在以下链接中找到: http://www.nature.com/ncomms/2013/130725/ncomms3207/full/ncomms3207.html?WT.ec_id=NCOMMS-20130731

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光片显微镜的Andor解决方案

sCMOS相机已被证明是高速光片显微镜的理想探测器。Andor拥有一系列非常适合发育生物学研究的sCMOS摄像机:

的和或Neo 5.5而且Zyla 4.2 PLUS系列已被广泛使用，因为它们提供了必要的大视场和高分辨率，而不影响读取噪声或帧速率，6.5 μm像素尺寸非常适合于光片显微镜。新Sona背光sCMOS相机连接这些模型，具有类似的传感器格式，但具有更高的95% QE。

这些相机6.5微米的小像素尺寸确保了pointspread函数的足够过采样，即使对于倾向于用于大样本的低放大倍率物镜(例如10x NA 0.3;20x NA 0.5)。读取噪声也很低，这意味着图像中的噪声下限很低。Zyla 5.5可以实现低至1.45 e- rms的读噪声，而Zyla 4.2的读噪声为1.1 e- rms，两者都没有信号放大，同时以每秒100帧的速度分别读取550万像素和420万像素。最新的Sona结合了非常低的读噪声，降至1.29 e- rms, QE达到95%，同时在完整的16位操作中提供每秒74帧。