蜻蜓500
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光学显微镜的分辨率是光的衍射极限的限制,这意味着结构接近200海里不能区分,除非研究人员使用超分辨率技术。超分辨率方法的另一种方法是由爱德华Boyden麻省理工学院的实验室在2015年(陈et al ., 2015)。而不是增加光学显微镜的分辨率,扩张显微镜“扩展”样本各向同性的。这种技术已经获得很多的关注,不仅因为它是一个替代的超分辨率方法,还因为它可以结合现有的超分辨率技术,进一步增加了显微镜的极限“看”。协议的一个完整的总结扩张显微镜,请阅读我们的技术文章扩张显微术是什么?。
然而,有挑战要克服成功形象扩大样本。的一个主要挑战是荧光的损失引起的不同步骤的协议。固定程序应用到细胞器的复杂性导致抗体标签问题,导致样品与低信号。在扩张过程中聚合物的单体交在细胞,然后,一旦进入,聚合引发(凝胶)。在凝胶中,低效的保存在水凝胶交联导致分散的信号。接下来,均化步骤旨在避免样品变形并确保标本组织保持完好无损。然而,荧光信号在均化作用可以降低到60%。在实际的扩张,4倍扩张意味着64倍体积膨胀;因此,荧光团密度和荧光信号的亮度降低64 x。因此,成像扩大样本需要足够灵敏的仪器来检测低光信号。 Other challenges consist of dealing with the expansion itself including imaging a very large field of view (Figure 1.), and imaging deep into the sample. These requirements are problematic and difficult to achieve with conventional microscopes.
图1所示。共焦图像的海拉细胞非扩展微管(右)和4.5 x线性扩展微管(左)。在一个执行成像和或高速时不时共焦显微镜(蜻蜓)40×,数值孔径(NA) 1.15 -水浸的目标。(一)共焦图像应用海拉细胞的微管,在单个xy平面成像底部的细胞。插图在左上方的缩放在中间的小盒子。(B)共焦图像×4.5∼线性扩展与应用海拉细胞微管,在单个xy平面成像底部的细胞。插图在左上方的缩放小盒子底部的左边。规模的酒吧(B)表明post-expansion鳞片。只有一小部分扩大细胞填充整个视野。各自的insets显示缩放各自的小盒子完整的视野。(张,C。,等,目前神经科学协议,2020)。
为了克服信号损失扩大样本,需要一个高度敏感的采集系统。研究人员需要使用显微镜,可以促进最佳的交付样品和极其高效捕获所有样本的光子,即。高量化宽松探测器。高度敏感的摄像机的使用基于摄像头共焦系统变成理想的解决方案来捕获所有信号扩大样本,甚至最黑暗的的人。
此外,形象扩大样本与高生产力、大视场的收购是必备的。多点共焦显微镜图像提供瞬间的大视场收购,因此,完美的解决方案。多点共焦需要优化针孔间距为避免pinhole-crosstalk,允许成像深入厚扩大样本。此外,厚扩大样本大,在很多场合,需要多个瓦片能够收集所有的三维信息等的示例中显示的例子图2和视频1。理想情况下,系统应该有一个非常平坦均匀照明,当与软件结合使用,可以实现无缝拼接。
视频1。小鼠海马扩大样本捕获和或蜻蜓呈现在伊万里瓷器。视频中研究人员利用大蜻蜓视场和北欧化工高度均匀的照明。结果交付一个完美缝合小鼠海马电影细节在脑细胞可以清晰的可视化。由詹妮弗Santini,加州大学圣地亚哥分校医学院的显微镜的核心设备
使用多个波长是一个重要的要求将允许用户标签的众多目标样本和获取信息的本地化不同结构以及它们与对方。使用近红外(NIR)波长是一个额外的好处,不仅扩展了荧光染料托盘,但非常重要的是,样品近红外光谱波长穿透得更深。
此外,使用超分辨率技术成像扩大样本将负担提高分辨率。例如,扩张显微镜结合SRRF(超分辨率径向波动)将增加至少一个额外的2 x光靠扩大样本获得的分辨率。
Figure 2。线粒体的最大投影图像导入受体。细胞在标签使用post-expansion协议与HSP70(胞质细胞器的膜-紫色),TOM20(外线粒体膜-橙色),DAPI(核-青色),和图像和或蜻蜓。由行Verckist,安特卫普大学。
和或建议蜻蜓共焦配备的iXon超888背景EMCCD,或者是Zyla 4.2便士sCMOS相机显微镜的扩张。双镜头旋转磁盘系统,加上高度敏感EMCCDs和sCMOS探测器提供了一个高质量的图像即使在样品染色较弱。蜻蜓已经优化针孔间距使成像深入样品没有针孔相声。进一步,和或专利北欧化工照明整个视野提供均匀的照明,这是一个关键因素对成像多个瓦片大扩大样本。结合大视场,22毫米对角线,蜻蜓可以提供出色的图像以惊人的效率。
在下表中,我们介绍如何蜻蜓旋转磁盘地址共焦成像扩大样本的当前和未来的挑战
| 关键需求 | 解决方案扩展显微镜 |
| 形象大样本 | 扩大样本比客观的视野,显微镜,可以获得快速和深度是必需的。蜻蜓是一种即时共焦,10倍点扫描共焦。蜻蜓有非常广泛的视野与22毫米的对角线。内部的分束器蜻蜓允许同时收购2通道与独立的相机。 结果1——获取图像高速400帧每秒的速度,提高工作效率。 结果2——大视场允许获得更多的数据在一个图像,提高效率。 检测两个独立通道同时不影响速度或决议。 |
| 图像厚样品 | 扩张后的试样厚度增加。扩张显微镜标本主要由水、细胞和组织的折射率异构性问题通常导致光学畸变现在可以忽略不计,深度成像直接[13]。蜻蜓擅长成像厚标本如瀑样、脑组织或胚胎。自定义磁盘旋转小孔距导致减少串扰针孔和25之间µm针孔是理想的成像厚样品这个选项提供了最佳的轴向分辨率。 结果1——在所有三维空间成像与细节。 结果2——图像通过数百微米轴向的轴向分辨率和高对比度。 |
| 均匀照明&扩展光谱范围 | 扩大样本往往需要收购多色3 d蒙太奇,均匀的照明领域获得完美的蒙太奇是至关重要的。和或北欧化工™专利整个视场照明技术提供了一致性。ILE激光引擎支持广泛的激发波长从紫外到近红外光谱(400 - 800海里)。GPU加速缝合机集成在融合软件可以用来获取和生产超高速和无缝的蒙太奇重建。 结果1——增加图像信号的至少两倍。 结果2——获得多个瓦片和建立一个蒙太奇。 结果3——直接可视化的数据:建立你的缝合形象而获得。 结果4-扩展光谱范围:荧光染料选择更大的灵活性。 结果5——使用近红外光谱波长更深的样本渗透。 |
| 检测微弱信号&交付高质量的数据 | ExM构成的主要挑战之一是它对荧光信号的影响。EMCCD和sCMOS相机使用的蜻蜓提供高灵敏度和量子效率与16位的动态范围。 结果1检测灵敏度高,检测非常微弱的信号。 结果216位对应于65536年灰色的水平。用户可以获得所有的信号在一个单一的形象,从微弱的亮。 结果3量高量子效率,捕捉几乎所有样本的光子。 |
| 提高横向分辨率 | 扩张显微镜是超分辨率不错的选择。但事实证明,这种技术也公布更多的细节,以前看不见的结合时超分辨率(8、14)。因为样品是扩大和厚,超分辨率技术,可以获得细胞或组织深处是可取的。 和或EMCCD和背景sCMOS相机提供一个集成的许可证SRRF(径向和或波动的内置SRRF-stream超分辨率算法允许实时SRRF立即计算和可视化的super-resolved图像。SRRF兼容传统的荧光团,不需要复杂的样品准备工作或特殊光学。SRRF兼容共焦,TIRF和宽视野成像,成像。 结果1——横向分辨率增加额外的解决你的扩大样本(2 - 6倍)。 结果2——获得额外的决议没有任何进一步的样品制备。 结果3分辨率,增加额外的样品可以获得数万µm深处组织。 |
| 多路复用成像 | 的水溶液性质扩大样本和生物分子的间距可能打开门高度复合成像。蜻蜓是一个很好的解决方案多路复用原位杂交由于最近将rest api。融合的rest api允许蜻蜓很容易引发成像并与其他设备同步多路复用。 结果1——多路复用装置的自动控制。 结果2-灵活的协议,可以调整实验。 |
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