显微镜学校第5课-荧光显微镜原理

我是克劳迪娅·弗洛林多，安铎生命科学公司的产品专家。在今天的网络研讨会上，我将解释荧光是如何工作的，做荧光显微镜实验和获取图像所需的硬件是什么，荧光显微镜的注意事项是什么，然后如何设置和设计你自己的实验。让我们从头开始。什么是荧光?

荧光是由原子或分子发出的光子，这些原子或分子的电子被瞬时刺激到更高的能量状态，并从基态能级上升到更高的能级。一旦它们回到基态，就会发射光子，这就是荧光。我们这里有一个原子的代表你有原子核和电子在周围运动。一旦有外部辐射进来，电子会进入一个更高的能量态，然后它们会下降到较低的能量态，它们会发射光子。当电子回到地面时释放的能量总是比激发电子的能量要低。因为这个原因，这个光子会有一个波长，比入射光的波长长。

因此，当入射光停止存在时，荧光发射将自动停止存在。能发出荧光的分子被称为荧光色素。事实上，在显微镜中，我们已经在荧光显微镜中使用荧光色素，它们的吸收和发射光谱都有很好的表征。所以，对于一个给定的氟色素，我们知道它会吸收特定波长的光。所以，我们知道应该用哪种光激发它，我们也知道特定的荧光色素的发射波长所以我们知道应该用哪种滤光器来捕获来自这种荧光色素的光。这些是特定荧光色素的最大吸收和发射峰。

斯托克斯位移是以纳米为单位的某一氟色素的吸收峰和发射峰之差。至于荧光色素，有几个特性会实际影响荧光色素的亮度，如化学环境、pH值、氧化还原电位、离子强度等。荧光剂有几个非常重要的特征。其中之一就是量子效率，即吸收光子与发射光子之比。这意味着量子效率越高，这个氟色素就越好，这个给定的氟色素能把吸收的光转化为发射的光，所以它就会越亮。

耐淬火。猝灭是一个降低样品荧光强度的过程。几种分子间的相互作用可导致猝灭，如分子重排、能量转移和基态络合物的形成。因此，当荧光色淬灭后，其发出的荧光会大大减少，对光漂白的抗性也会大大降低。光漂白是指荧光染料的荧光照射所造成的不可逆损伤。所以，当它被光漂白时，它会发出荧光，它不再发出荧光。

以下是生命科学中常用的荧光剂概述。我们有化学染料，如亚力克色、海利特和菁染料。这些例子是DAPI吖啶橙和俄勒冈绿。大多数生物染料来自绿色荧光蛋白，尽管目前有其他生物产生这些荧光蛋白，它们进化为我们提供了彩虹色的调色板。再谈谈荧光蛋白，就像我刚才提到的，荧光蛋白有多种颜色可供研究人员使用他们可以用这些荧光蛋白做多种颜色实验。

它们中的大多数来源于最初的GFP, GFP代表绿色荧光蛋白，但其中一些实际上来源于在其他生物中发现的新蛋白质。但是荧光蛋白不仅仅是在彩虹的所有颜色中发光，荧光蛋白已经很多了。有可转换的荧光蛋白。这些蛋白质开始在给定波长的光中辐射。但一旦激发，改变到另一个波长的发光。这使得，在一个给定的实验中，可以在一个单一的时间点上专门追踪超级细胞群。

另一个例子是光激活荧光蛋白，它在被照射和激活之前不会发光。甚至是可光转换的荧光蛋白，蛋白质开始有一个发射波长，比如绿色。一旦被照射，改变它的发射波长变成红色，再被照射，它又会变成绿色。这些是荧光蛋白的几个例子，可以用于多种应用，如CRISPR技术，光遗传学工具，等等。万博电脑网页版登录

现在，我们来看看EP荧光显微镜的硬件。我们从光源开始。有一种光源，它会发出适合荧光显微镜的几种波长的光。然后，我们需要一个过滤器立方体来选择合适的波长。过滤器组是如何工作的?它将有一个激发势垒，一个二色镜，和一个发射滤波器，激发势垒或激发滤波器。然后我们有了物镜，两种混合和探测器，大多数情况下是一个相机。这里我们有一个安多尔相机的例子。我们有光源。光源会发出多种波长的光，但我们只想用蓝光激发。

我们有一个激励滤波器，它只会选择合适的波长到达样品。它进入物镜，也就是样品，被另一种波长反射回来，波长较长，能量较低的光。反射蓝光的二向色光现在将允许绿光通过，而发射滤光片作为进一步的屏障来进一步选择我们想要获得的波长。至于可以用于荧光显微镜的光源，我们有汞弧灯、氙弧灯、金属卤化物灯或led灯，由于它们的能量辐射较低，目前使用较多。它们对荧光显微镜非常有用。或者如果你使用一个多模态系统，如蜻蜓，你可以使用集成激光引擎，ILE，激光宽视场照明。

再往过滤器立方体里面看一点。滤光片的主要组成部分是，如我之前解释的，激发滤波器，第一个屏障，它将从光源中选择所需的波长，二色镜，它将作为一面镜子，将所需的波长反射到样本，然后允许发射光通过激发滤波器和探测器。然后激励滤波器作为进一步的屏障来选择我们想要的特定激励下的精确波长。那么，从图形和波长的角度更详细地解释一下，什么是滤波器集以及它是如何工作的?

我之前提到过的滤波器设置将会再次强调它将允许特定波长的样品的激发，也将允许在激发后从样品发出的特定波长的检测。用图形表示，我们有一个激励滤波器，它选择特定波长的通道。这里是二色镜，它反射这条线以下的波长。我们想象这将是400纳米，低于400纳米，但允许波长比这些长。这里是发射滤波器，它将作为进一步的屏障从发射的波长中进行选择。

总之，激发滤波器特别允许激发波长的光通过。二色镜将引导激发波长的光照射到样品上，并专门允许发射波长的光通过，而发射滤波器将进一步将通道串起来。到达探测器的光。因此，不同类型的滤波器根据它们区分不同波长的能力被命名为不同的。励磁滤波器通常是短通滤波器，因为它们允许更短的波长通过。发射滤波器通常是长通滤波器，允许较长的波长通过，并阻挡较短的波长。二色滤光片或分光镜反射某些波长，而允许其他波长通过。

也有窄带通滤波器，可以阻挡较短和较长的波长，只允许波长的窄带通过。利用不同滤光片和二色镜的特性，我们可以创建一组特定的滤光片集，足以进行多色荧光成像实验。两种基本类型的过滤器可以使用，单色和多色过滤器集。单荧光滤波器组将实现更高的信噪比，但成像速度较慢，而多色滤波器组将实现更快的成像，但低信噪比。

现在我们来谈谈显微镜的一个非常重要的部分，那就是物镜。必须记住显微镜下的所有东西都是重要的。举个例子，如果你计划使用DAPI，你有一个紫外线过滤器，一个专门用来在显微镜中显示DAPI和紫外线染料的过滤器，你在DAPI中染色你的样品然后你到显微镜下，你就看不见了。也许你的染色不起作用。好吧?但也有可能是另一回事。如果你的目标无法传输紫外线染料，紫外线波长怎么办?如果是这种情况，你将永远不会看到带有这种目标的DAPI。因此，您需要了解您正在使用的硬件，并根据特定的硬件调整您的实验设置。

所以，物镜的类型是无色剂，萤石，和消色剂等等，但它们会因所提供的校正类型而不同，因此，也会因所提供的成像类型而不同。NA越高，分辨率越高。NA的意思是数值孔径，它是物镜捕捉更大角度光线的能力。我已经讨论过对紫外线的透明度了，但其他对物镜性能很重要的特性你们在考虑物镜时应该注意的是它们是否是由低荧光玻璃制成的。

此外，如果他们能够提供你需要的透射光技术，这些物镜有哪种类型的校正，比如萤石和防色剂，这是一个计划，这意味着，它们被校正为平场，也如果它们被校正为色平面位移。荧光显微镜中的物镜也起聚光镜的作用。

现在我要谈谈相机。我将简要介绍一下相机。如果你想对显微镜相机和探测器有更广泛的了解，请参阅本课程之前的演讲。那么，问题是，摄像头呢?荧光显微镜下的相机是彩色的还是黑白的?你已经知道答案了。在荧光显微镜中，最常见的是黑白相机。然后我们有了这些美丽的，五颜六色的图像。如果相机是黑白的，我们怎么可能有这些美丽的，五颜六色的图像呢?我们有这三幅彩色图像。 But in fact, what we do when we are acquiring is we acquire a micro tool grayscale image, a simple grayscale image, and the DNA grayscale image.

然后，我，这个相机，这个软件会把所有这些被映射成65000个灰度度的灰度图像，如果这是一个16位相机，转换成65000个绿色，红色和蓝色的灰度，颜色就会出现。这就是我们的彩色图像。我们为什么要做这些?为什么我们不能立即获得彩色相机呢?对于彩色相机，想象这是一个16像素彩色相机的芯片。通常情况下，为了让我们的眼睛与彩色相机相匹配……所有像素都用滤镜进行屏蔽，滤镜的颜色可以是绿色、红色或蓝色。为了更好地匹配我们的眼睛，如果这是一个16像素的相机，在这16像素中，有一半，也就是8，是绿色的，1/4是红色的，1/4是蓝色的。这个会在…如果要探测16个像素分辨率的光，我们只需要…可以分别检测到8个绿色和4个红色，蓝色。 Therefore, we would have less resolution on a color camera than if all the pixels would be detected for each color individually. On the other hand, if I have a black and white camera, and I have the light source, it goes to the sample, it goes into the detector, all my pixels will be used to capture the green light, the blue light, and the red light. And therefore, I will have more resolution in a single image.

所以，荧光显微镜的注意事项。荧光显微镜的注意事项包括自发荧光，即可用的荧光滤光器集的渗漏效应，即发射并被绿色荧光滤光器集捕获的荧光色素也可以被紧邻的红色滤光器集捕获。这是一个绿色和红色的例子。但我的意思是，从氟色素发出的光，应该被滤光片集合a捕获，不仅被滤光片集合a捕获，还被相邻的滤光片集合b捕获。染料光漂白是氟色素的不可逆损伤和生命细胞光毒性。生命细胞光毒性顾名思义，意味着细胞在活体成像实验中死亡，因为高能辐射对它们是有毒的。

自身荧光的原因包括内源性分子的自身荧光，对给定实验不理想的过滤器的使用，以及对所使用的固定剂的反应性。人们需要记住，记住不同的固定剂会引起不同的自身荧光是很理想的。所以，第一，我们需要选择最好的固定程序，第二，适当固定我们需要可视化的蛋白质，如果可能的话，还要减少自身荧光。光在光路中的散射也会引起自发荧光。

我们再来谈谈渗透效应。当成像多个荧光色素或荧光蛋白时，由于来自一个特定结构或蛋白质的信号将在相邻的滤波器集中捕获，并将掩盖来自两个蛋白质或结构的信号，因此出血效应非常相关。漏光的原因包括一个非理想的滤光片组，其中带通波长非常接近，没有优化到所使用的荧光色素，也与此相关，一个非理想的荧光色素选择的实验或显微镜设置。

可能的解决办法是，减少曝光时间。如果你减少曝光时间，你就会减少渗漏效果。使用带通较窄的高比滤波器。但是可能总是会有一些信号交叉所以请进行实验的控制以确保你没有漏信号或者你知道漏信号的数量也就是你从一个通道漏到另一个通道的曝光量。谈论染料光漂白。所以，染料光漂白，就像我之前提到的，是氟色素的可逆损伤，这里有一个染料光漂白的例子经过10次激光扫描后几乎停止了任何光的照射，因此它对探测器来说几乎是看不见的。所以，请注意避免光漂白。

再讲一点染料光漂白。因此，染料光漂白在时间推移显微镜中也非常重要，这一点并不奇怪。这是一个电影的第一个时间段的例子，和电影的最后一个时间段你几乎看不到被组蛋白GFP染色的细胞核。关于染料光漂白，我们再讲一点。这是由于氟化铬曝光度增加引起的。这种暴露将导致自由基的形成，自由基将导致荧光色素分子的修饰，从而导致荧光减弱。它将导致从单线态到三线态的转变。最重要的是，光漂白是不可逆的。所以，一旦我们漂白了荧光团，它就不再发光了。避免光漂白。 To avoid photobleaching, please use the most photostable dye possible.

减少样品中的氧气。你怎么能做到呢?你可以使用氮气和氧气清除剂。在嵌入介质中使用防褪色试剂。毫不奇怪，减少你拍摄照片的曝光时间。然而，任何事情，如果对我们有利，都可能是一件好事。所以光漂白并不都是坏事。有一种非常著名的技术可以进行多种应用研究分子的扩散动力学，囊泡运输动力学，沿着微管的运输动力学，叫做FRAP。FRAP代表光漂白后的荧光恢复。这是一项技术，它可以可视化细胞在特定区域的荧光恢复有多快，一旦它受到如此多的光照射，所有的荧光色素都被漂白了。

这样就可以确定分子从细胞的一个区域到另一个区域的扩散系数。这是一个FRAP的例子使用安铎马赛克这些特定的区域被漂白了。你可以看到它们变黑了。然后你可以看到分子从细胞的其他地方扩散到黑色区域。继续，关于荧光显微镜的注意事项，我现在要谈谈活细胞的光毒性。传输紫外线的光源会对我们试图成像的细胞造成损害，这并不奇怪，因为我们都知道，如果我们不带防晒剂就走到太阳下，我们会被晒伤。细胞也会受到一种灼伤，不是晒伤，而是高能量的光灼伤，我们在进行实时成像时需要避免这种灼伤。

那么，问题是什么呢?其中的一些问题是所用的滤光片和二色镜在阻挡类紫外线波长方面并不完全有效。这种无法阻挡这些波长的情况会导致细胞壁，细胞膜的损伤，导致细胞的快速死亡。解决这一问题的方法包括使用紫外线过滤器减少紫外线辐射的影响，缩短曝光时间，平衡氧化还原环境。使用激光宽场消光法，只用所需的波长线选择性地照射样品。而且，重要的是，使用较长的波长，能量较低。如果可能，使用近红外波长。它可以避免紫外线。它在光谱的另一端。

近红外波长波长较长，能量较低。所以，这对细胞更好，更健康，它也提供了允许更深入渗透到样本的优势。大多数引起自身荧光的分子在近红外波长上不发荧光。这实际上是开始使用这个波长的一个很好的赌注。最近，已经有一些荧光蛋白和荧光色素化学染料可以使用这些近红外波长。而且，重要的是，如果你在选择的时候，选择一个与实时成像实验兼容的系统。其中一个系统可以是，例如，双微透镜旋转盘系统。

现在，谈谈设置和设计。当你设置和设计一个实验时，你需要考虑我的研究所有什么显微镜?那些显微镜有什么过滤装置?还有，不要……不要忘记，就像我之前提到的，里面有什么目标?有哪些激光线路可用?最重要的是，我想做什么?那么，我想做什么呢?我想成像一个活的样本还是一个固定的样本?我是想做多色实验还是单色实验?

在做这样的实验时，我要怎么染色呢?我会用荧光抗体，荧光蛋白，或者量子点。我要用什么呢?我需要选择合适的荧光色素或荧光蛋白这样才能被我将要使用的设备看到。我需要设计样品制备方案。在使用显微镜之前，设计成像采集协议是非常重要的，但有时会被忽视。我想如何获取我的图像?

总之，在这次演讲中，我向你们介绍了荧光是如何工作的，EP荧光显微镜的硬件要求是什么，荧光显微镜的注意事项，以及建立和设计荧光实验需要考虑的问题。现在，我要感谢大家来听我的演讲。我想邀请你们继续学习我们的Andor显微学系列。接下来，你们将学习共聚焦显微镜和免疫组织化学样品制备。非常感谢你们的聆听，我希望你们能参加这门课程的后续课程。