拉曼和荧光流式细胞术简介

介绍光谱流式细胞术

光谱流式细胞术流式细胞术是一种基于传统流式细胞术的技术，用光谱仪和多通道检测器(通常是CCD)代替传统系统中的反射镜、滤光片和光电倍增管。流式细胞术允许对单个细胞或颗粒的数据进行快速多参数收集和分析。

基于色散光学的系统提供了更简单的设置，同时提供了使用更多测量参数的可能性。传统的系统已经发展到提供更多的同时可测量的参数:系统有多达19个参数可用(直接散射，侧散射和多个荧光通道)，但这需要多个pmt，过滤器，几个激光器，多个荧光团标签和波长选择镜。

尝试将这种系统扩展到更多通道的问题，除了费用和操作上的挑战外，是荧光团固有的广泛荧光特性。在后一种情况下，使用的荧光团荧光带越多，波段的重叠越多，区分不同参数通道上的单个信号变得越来越困难。使用光谱反褶积算法的摄谱仪有可能为多颜色或多参数分析提供更全面和灵活的方法。

荧光纳米晶体和电子倍增CCD探测器

两项关键技术的发展为光谱流式细胞术(SFC)仪器的发展增添了新的动力:1)具有宽吸收带和相对窄发射带特征的荧光纳米晶体的可用性电子倍增CCD探测器(EMCCD)，灵敏度大大提高。

有几个小组正在研究光谱流式细胞术，其中一些使用APD阵列或多阳极pmt实现了多通道检测。其他公司正在使用CCD探测器，并特别关注EM技术，将其作为获得所需速度、灵敏度和分辨率的手段。SFC系统的目的是提供高速分析速率，并最终实现细胞/颗粒分选。目前，光谱流系统的分析速度相对较慢，这将成为该技术发展的关键挑战之一。

表面增强拉曼光谱

小组的主要焦点一直是荧光光谱的使用，但一个小组现在已经证明了一个系统使用拉曼光谱更具体地说表面增强拉曼光谱(SERS)。考虑到SERS可能显著增强信号，SERS发射可以具有与典型荧光团相似的亮度。在SERS中，小纳米颗粒被设计用于增强激发能与感兴趣的物种分子的耦合(通过等离子体共振激发过程)，拉曼特征的较窄带促进了更大的数据复用。

图1显示了一个流动池的示意图和流体动力学聚焦的原理，以给出一系列用于测试的单个细胞或颗粒。

图1:流动池示意图

流体的流体动力流动被用作护套，它被聚焦成一个更窄直径的流动，当它们通过流池的测试区域时，导致细胞或颗粒密度的分离。用激光激发样品细胞的光谱活性位点。通常测量两种散射参数，1)来自激光源的前向散射，2)也将在激光波长处的侧向散射。与这些相关的是光谱信号，通常是来自不同荧光色的荧光信号;这些信号通常在与激发激光方向成90度的侧通道中被带走。

在传统的流式细胞仪中，荧光信号被分离到特定的波段，使用一系列边缘滤波器和二向色镜，每个单独的通道都是用PMT测量的。然而，如本文所述，在光谱流式细胞仪中，包括荧光在内的侧散射光被收集并耦合到摄谱仪中(直接或通过光纤)，在摄谱仪中，整个光信号被分散并在CCD或多通道检测器上显示为高分辨率光谱。在这样的系统中也测量了拉曼光谱。

下面的图2显示了基于光谱的流式细胞仪的结构示意图。它是一个平面视图，流体通道的流量进入该页。激光聚焦到流动池中，以确保激发耦合方面的最高效率:在某些配置中，交叉圆柱形透镜用于定义感兴趣的矩形区域，以便在样品细胞流过时“询问”它们。前向散射作为关键参数，通常用光电二极管(PD)或光电倍增管(PMT)测量;在这条光路中加入了一个光束阻挡器，以切断直接的激光并保护探测器。这个参数对于散射粒子的大小信息是特别重要的。

图2:流式细胞仪示意图

在这个原理图中，一些成像光学器件和一个相机位于侧面，以方便样品和激光的对准。在这种情况下，侧散射和光谱信号(包括荧光或拉曼)通过显微镜物镜耦合到光纤中，光纤反过来将光信号传递给a高通量摄谱仪。一些几何图形通过收集光学元件将光直接耦合到摄谱仪中，即没有光纤。

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